A novel platform technology of enzyme assay using microfluidic channels was developed. The microfluidic device for alkaline phosphatase assay was fabricated by micromolding processes with PDMS (polydimethylysiloxane) polymer. This microfluidic device can be provided a novel assay platform which can overcome limitation of the conventional assay platform, which contains the requirement of special detection instrument, manual dilution of the substrate solution and individual measurement of enzyme reactions. In this study, ELISA reader instrument was used as a detection system and the substrate solution of different concentration was generated by microfluidic channel network. Enzyme reactions were measured in ELISA reader instrument, which occurred in six reaction chambers containing each different concentration of substrate solution. Reaction chambers also functioning detection chambers has been arranged in 96-well formats to be operated by ELISA reader. Overall dimension of the microfluidic device was the same size as a 96-well microplate. Enzyme activity was determined with the continuous methods that are generally an instantaneous observation, which was measured by ELISA reader instrument. Also the enzyme activity is possible to be estimated by stop method. In this thesis, stop method of enzyme assay was used as a standard assay, which showed error bars of less than ±1.7% enzyme activity. Employing the patterns of microfluidic channels, the substrate solution was diluted in serial and the enzyme solution was injected into the detection wells simultaneously. Dilution effect was examined by red food dye with error bars of less than ±9.43% absorbance and the experimental results have difference from the predicted value less than 1.82 % relative absorbance. The predicted values are calculated by the concentration equation derived in this paper. Initial velocity of enzyme reaction is measurable soon after enzyme and substrate solution is mixed together at six detection wells. The unit of initial velocity measured in instrument was converted for AU/min to the unit of μmol/min by Beer-Lambert relationship. The [S]/Vo vs. [S] plot, which is modified formula of Michaelis-Menten relationship, provides Vmax. The [S]/Vo against [S] was plotted with error bars of less than ±13.15% y axis. The obtained Vmax and enzyme activity which came from the stop method were plotted with error bars of ±11.3%. Eventually we can determine the enzyme activity (unit/L) of unknown enzyme solutions and the assay with unknown sample showed errors of less than 10.1 % enzyme activity.
The PDMS device for enzyme assay is available to measure the enzyme activity simply and rapidly. It takes less than 1 minute and spends 140μL of enzyme solution and 240 μL of substrate solution to assay alkaline phosphatase. Detection range of enzyme activity is from 14.52 (unit/L) to 377.7 (unit/L). This microfluidic device can be applied to diagnostic fields to determine the progress of diseases such as Paget…s disease, osteoporosis, which are almost related with bone and liver disorder by assay alkaline phosphatase in human whole blood.
본 논문에서는 미세 유체 채널을 이용한 alkaline phosphatase 활성도 분석 기술에 관한 연구를 수행하였다. 기존의 효소 활성도 분석법은 효소 반응을 측정하기 위해 특별히 제작된 측정 시스템을 별도로 갖추어야 하였고 다른 농도의 기질 용액을 연구자가 직접 실험 전에 준비를 해야 한다는 것, 그리고 다른 기질 농도에서 효소 반응을 개별적으로 측정함으로써 전체적인 분석 시간이 증가하는 문제점을 갖고 있었다.
본 논문에서는 기존에 생화학 실험실에 보급되어있는 ELISA 측정 장비를 사용함으로써 특정 분석 시스템에서만 사용 가능한 고가의 광학 장비의 제작 필요성을 제거하였다. 미세 유체 채널 구조를 이용하여 여섯개의 다른 농도를 갖는 기질 용액을 형성시켜 효소 반응을 측정함으로써 전체적인 분석 시간을 최소화 할 수 있는 효소 분석 기술을 확립하였다.
효소 활성도 분석을 위한 PDMS 칩은 기질농도를 희석시키기 위한 부분과 효소 용액을 주입하기 위한 부분 그리고 효소-기질 반응에 의한 발색 반응을 측정하기 위한 반응 챔버로 이루어져있다. 효소 분석 방법은 효소 카이네틱스(enzyme kinetics)를 이용한 연속 분석법(continuous method)에 의해서 이루어졌고 측정 챔버는 96-well 마이크로플레이트(microplate)와 같은 위치를 하고있어 ELISA 측정 장비에서 사용이 가능하도록 설계 및 제작하였다. 각각 다른 기질 농도에서 효소-기질 반응을 광학적으로 측정함으로써 초기 반응 속도를 동시에 얻어 낼 수 있었고 마이캘리스-멘튼 관계식(Michaelis-Menten relationship)을 이용해 초기반응 속도 (Vo)와 기질 농도를 Vmax 값으로 전환할 수 있었다. 각각 다른 효소 활성도를 갖는 효소 샘플 용액( 14.52 unit/L, 118.2 unit/L, 281.7 unit/L, 292.9 unit/L, 377.7 unit/L)으로 효소 활성도 분석을 하여 효소 활성도와 Vmax 값 간의 관계식을 얻어 낼 수 있었고, 이 결과는 ±11.3% 이내의 오차를 가졌다. 미지의 활성도를 갖는 효소 용액을 시료로 PDMS 칩을 사용하여 Vmax 값을 구함으로써 효소 활성도 (unit/L)를 얻어낼 수 있었고, 소자에서 측정된 활성도 값은 정지법에 의해 얻어진 효소의 활성도 값과 비교 할 때 10.1 % 이내의 오차를 나타내었다.
순차적인 기질 희석을 위해서 미세 유체 채널을 이용하였는데 복잡한 미세 유체 채널 네트웍에서 주입된 두 용액의 농도와 각 반응 챔버에서의 농도를 수식 (6) 과 같이 유도하였으며, 이 관계식을 통해 주입되는 두 농도 ($C_1$ =3.0 mM, $C_2$= 56.8 mM) 가 각 반응 챔버에서 어떤 농도로 존재하는지 예상할 수 있었다. 이 관계식의 신뢰성을 확인하기 위해 색소를 이용해 실험한 값과 수식 (6)에 의해서 예상된 값을 비교한 결과 실험에 의한 측정 값은 예측값과 1.82% 이내의 오차를 가졌으며 실험에 의한 측정된 데이터는 ± 9.43 % 이내의 오차를 나타내었다.
제작된 PDMS 칩은 마이크로공정 기술(microfabrication process technology)에의해 제작된 몰딩 주형에 PDMS 전물질(prepolymer)를 부어 경화시키는 방식으로 제작하였으며, PDMS 본딩은 PDMS 표면을 공기 플라즈마(plasma)를 처리하여 활성화 시킨후 비가역적 접착을 하였다. 기질과 효소 용액은 시린지 펌프(KDS-100)으로 주입하였고 기질 희석시에는 주입되는 두 농도의 유속을 갖게하여 정상상태를 유지하도록 하였다.
이번 연구에서 제작된 칩은 생화학적 실험에서 효소 활성도 분석 및 골질환이나 갑상선, 간질환 등 의료용 진단 소자로 사용할 수 있는 장점을 갖고있으며 혈액을 추출하여 응고시킨후 남은 황색 상층액의 혈청을 이용하여 혈액내의 알칼라인포스파테이즈의 활성도를 분석하는데 응용될 수 있다고 전망 된다.
