Microbial fermentation technology has been widely used as academic and industrial methods to treat wastewater and food-waste, produce useful proteins. In large scale aerobic fermentation processes, however, a high cell density culture was actually regarded as impossible method due to dissolved oxygen limitation and low competitive power.
In this research, Hansenula polymorpha GOT7 was used as microorganism to investigate whether high purity oxygen affects secreting human serum albumin during batch and fed-batch fermentation processes.
The optimum cultural conditions were established in advance through several basic flask cultures. Hansenula polymorpha GOT7 was shown best expression quantities at pH 6.0 and 37 ℃.
Researches were progressed based on these results. The objectives of batch fermentation cultures were to confirm the mechanism of methanol oxidase promoter which regulates human serum albumin expression and investigate high purity oxygen effect. To achieve these two objectives, culture medium and supplied gases were changed at each case. The results showed that the most albumin (3.136 g/L) was secreted when YPG medium which contained glycerol were used. In case of YPD medium, human serum albumin was increased at 1.46 times, and 1.29 times at YPG medium.
In fed-batch fermentation cultures, the effects of two important factors, carbon source feeding strategy and high purity oxygen supplying strategy, were investigated. In culture with YPG medium and high purity oxygen condition, specific growth rate, μ, was regulated manually to decrease slowly (gradual feeding) and induced with methanol. The results were 2.15 times increase (5.762 g/L) when compared with YPG medium and air condition (2.680 g/L). These increases were mainly due to the growth of cell mass.
These experimental results showed the possibility of large scale microbial fermentation with high purity oxygen and high cell density cultures.
미생물을 이용한 배양 기술은 수십 년 전부터 학술적 가치뿐만 아니라 산업적 가치를 인정 받아 음식물 쓰레기 처리, 폐수 처리, 인체에 필수적인 각종 단백질 생산 등 많은 곳에서 사용되고 있다. 그러나, 대규모의 호기성 발효 공정의 경우, 용존 산소의 제한과 기존의 다른 제조 방법과의 가격 경쟁력의 차이 때문에 미생물의 고농도 배양은 현실적으로 불가능한 실정이다.
본 실험에서는 고순도 산소가 미생물에게 미치는 잠재적인 영향을 탐구하기 위해 호기성 균주인 Hansenula polymorpha GOT7를 이용한 회분식 및 유가식 발효 공정을 통해 전세계적으로 주목 받고 있는 인체 필수 단백질인 Human Serum Albumin을 생산하는 공정에 대해 연구를 수행하였다.
회분식 및 유가식 발효를 시작하기에 앞서 플라스크 배양을 통해 기본적인 최적 발효 조건을 밝혀내었다. 본 실험에 사용된 Hansenula polymorpha GOT7의 경우, pH 6.0, 온도는 36 ℃가 가장 적합한 배양 환경임을 알았다.
위의 결과를 바탕으로 회분식 발효 공정을 진행하였다. 인체 혈청 알부민의 발현을 조절하는 메탄올 산화 효소의 효과적인 유도 방법을 알기 위해 배지를 바꿔가며 실험을 진행하였다. 그 결과, glycerol이 포함되어있는 YPG 배지에서 가장 많은 양의 인체 혈청 알부민이 발현됨을 알 수 있었다. 또한, 고순도의 산소의 효과를 파악하기 위해 발효조로 공급하는 기체를 공기와 고순도 산소로 교환하면서 실험하였다. 발현 알부민 결과 분석에서는 고순도 산소를 이용했을 때, YPD 배지의 경우 1.46배, YPG 배지의 경우 1.29배 증가한 결과를 나타냈다.
유가식 배양에서는 메탄올 산화 효소의 유도 방법과 고순도 산소의 공급 방식을 변화하면서 이에 따른 인체 혈청 알부민의 발현 결과를 분석하였다. YPG 배지를 이용한 배양에서 글리세롤을 이용한 비성장속도(μ)를 서서히 낮춰주면서 메탄올로 유도했을 경우, 고순도 산소를 공급했을 때가 공기를 공급했을 때보다 2.15배 증가한 5.762 g/L의 인체 혈청 알부민 발현양을 보였다. 이와 같은 결과물의 증가는 고순도의 산소 공급을 통한 세포농도의 증가로 인한 결과였다.
위와 같은 본 실험의 결과는 고순도의 산소 공급을 통한 대규모의 미생물 발효 공정과 고농도 세포 배양 공정의 실현 가능성을 보여준다.
