Glutamine synthetase (GS) catalyzes the ATP-dependent conversion of ammonia and glutamate to glutamine. In the previous study, we found an additional exon (120 bp) in the first intron of GS gene. By means of alternative splicing, the GS gene produces an altered form of GS transcript with 5`-untranslated region (UTR) containing the additional exon. This alternative transcript is abundantly expressed in brain, whereas it is found at lower levels in other tissues. We have performed an analysis on the cis-acting regulatory sequences that reside in the intron immediately upstream of this mini-exon, designated here as intron 1a, using the exon-trapping system. We constructed a series of mutants, in which either whole or partial GS intron 1a was replaced with GS intron 4 which is efficiently spliced out. When this constructs were transfected into MDCK and Neuro-2A cells, we found that both the branch-site and the polypyrimidine tract in GS intron 1a serve as cis-acting elements in brain-specific alternative splicing. Furthermore, we observed that a sequence motif in the new exon has no SRp40 binding sequence in near 3'(acceptor) exon-intron junction. So we suspected that SRp40 functions as exonic trans-acting factor in the brain-specific splicing of canine GS gene. But in the exon-trapping experiment with the exonic mutant minigene constructs, it seems that the absence of SRp40 binding sequence motif in exon 1' is not related to GS alternative splicing. On the other hand, we describe a novel method for identifying candidate trans-acting factors that are involved in regulating GS alternative splicing. We generated a cell line that stably expresses a GS minigene-based GFP reporter construct, such that the levels of green-fluorescent protein (GFP) expressed in the cell reflect the splicing state of the GS gene.
전사단계와 전사후 단계에서 발현의 조절을 받는 글루타민 합성효소 (GS) 유전자는 개에 있어서, 다른 포유동물 들과 마찬가지로, 7개의 exon과 6개의 intron으로 구성되어 있다. 이전 연구에서 5’cRACE와 RT-PCR을 통하여 첫번째 intron내에 새로운 exon이 존재하는 것을 발견하였고, exon 1’으로 명명하였다. 선택적 스플라이싱에 의해, 개 GS 유전자는 exon 1’을 포함하는 변화된 전사체를 만들고 있었다. 이 새로운 전사체는 뇌에서 많이 발현되고, 다른 조직에서는 아주 약하게 생성되고 있었다.
본 연구에서는 exon-trapping의 방법을 이용하여 글루타민 합성효소 유전자의 선택적 스플라이싱에 영향을 주는 인트론과 엑손 상의 요소들을 찾고자 하였다. 그 결과, 선택적으로 스플라이싱이 되는 exon 1’의 앞에 있는 intron 1a 상의 branch site 와 polypyrimidine tract이 함께 선택적 스플라이싱을 조절하는 것을 확인하게 되었다. 즉, 이 branch site 와 polypyrimidine tract에 걸치는 부분이 intronic splicing silencer (ISS)로 작용해서 일반적인 스플라이싱 반응을 방해함으로써 , 글루타민 합성효소의 exon 1’이 선택적으로 스플라이싱이 되게 하는 것으로 보인다. 또한 글루타민 합성효소 유전자의 선택적 스플라이싱에 영향을 주는 엑손 상의 요소를 찾기 위해, ‘ESE finder’ 프로그램을 이용하여, exon 1’ 의 특이적인 특성을 찾아 보았으며, 그결과 exon 1’에 스플라이싱과 관련된 것으로 알려진 SR 단백질의 일종인 SRp40에 결합하는 염기 서열이 존재하지 않음을 알게 되었다. 그래서 exon-trapping의 방법을 이용하여 선택적 스플라이싱에서 SRp40의 역할을 확인하고자 하였다. 그러나 이 실험에서는 SRp40이 글루타민 합성효소 유전자의 선택적 스플라이싱에 특이적인 역할을 하지 않는 것으로 나타났다.
또한 본 연구에서는 GS-GFP fusion construct을 만들어, 이것을 발현시키는 stable cell line을 만들었다. 앞으로 이 cell line을 이용하여 글루타민 합성효소의 선택적 스플라이싱과 관련된 trans-acting factor를 찾고자 한다.
