Transcription from human mitochondrial DNA promoter has been recently reconstituted in vitro with three recombinant proteins: mitochondrial transcription factor A (TFAM), mitochondrial transcription factor B1, B2 (TFB1M, TFB2M) and the mitochondrial RNA polymerase (POLRMT). TFB1M is an essential component of the mitochondrial promoter dependent transcription process. Here we cloned the gene encoding TFB1M from human cDNA libraries and ligated it into the expression vector. The recombinant TFB1M was overexpressed in Escherichia coli and purified to near homogeneity, using metal chelate affinity chromatography on Ni-NTA affinity resin, followed by heparin-agarose chromatography. Expression of POLRMT alone in E.coli was not successful, because most of the protein was insoluble. We tried to stabilize POLRMT by coexpression POLRMT with TFB1M. The recombinant TFAM was purified by Ni-NTA affinity chromatography and phosphocellulose chromatography. Then the basic components of the mitochondrial transcription machinery in human now seem to be in our hands.
인체 미토콘드리아 전사 인자 B1 (TFB1M) 의 유전자를 인체 cDNA library 으로부터 중합 효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction) 을 통하여 클로닝하였다. 클로닝된 TFB1M 유전자는 2 종류의 발현 벡터에 다시 옮겨졌다. 만들어진 발현 벡터를 대장균에서 발현시키고 그 단백질을 순수 정제하였다. 두 종류의 재조합 단백질 중에서 6 개의 연속된 히스티딘 아미노산 서열이 C 말단에 있는 재조합 단백질이 N 말단에 있는 것 보다 안정했다. 인체 미토콘드리아 RNA 중합효소 (POLRMT) 는 단독으로 대장균에서 발현시켰을 때 대부분은 단백질이 불용성이었다. 이를 해결하기 위해서 TFB1M 과 POLRMT 를 같이 발현시켰으나 POLRMT 를 크게 안정화 시키지는 못했다. 인체 미토콘드리아 전사 인자 A (TFAM) 도 대장균에서 발현시키고 정제하였다. 따라서 인체 미토콘드리아 promoter 로부터 특이적인 전사를 일으킬 수 있는 기본적인 단백질들을 얻게 되었다. 이렇게 정제된 단백질들은 인체 미토콘드리아의 전사 및 복제 과정에 대한 조절 메커니즘을 연구에 하는데 이용될 것이다.
