We demonstrated the strategy of selection and identification of analyte proteins of interest by combining a chip-based biosensor with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). For this, the affinity surface of a biosensor chip was constructed over a dendrimer monolayer on gold by employing the interaction between bovine serum albumin (BSA) and its antibody. After trypsin digestion of captured BSA under optimized conditions, digested product was collected and analyzed through peptide mass fingerprinting with MALDI-TOF MS. The detection limit in this approach reached to about 100 femtomole level. The structural alignment of peptides obtained from on-chip digestion of 1pmol BSA revealed that exposed regions of BSA molecule, affinity-captured on an antibody layer, were likely to be trypsin-digested. Efficacy of a used chip platform to on-chip digestion was also tested in other antibody layers. In real applications of treating a protein mixture and human serum onto the prepared antibody layer, BSA can be detected down to a level of 0.1 ng/mL. Furthermore, specific proteins expressed in E.coli were successfully identified from a cell lysate. These results represent that combined use of a chip-based technique and MALDI-TOF MS is capable of identifying low concentration of analyte proteins in complex biological mixture.
인간 유전자 염기서열이 밝혀지면서 신약 개발과 질병 진단의 목적으로 단백질의 기능 및 상호작용을 신속하고 광범위하게 분석하려는 연구가 이루어지고 있다. 특정 단백질과 상호 작용하는 단백질의 분석을 위해 우리는 단백질칩과 MALDI-TOF MS (이온화질량분석기)을 결합시키는 접근 방법을 시도하였다. 단백질 간 상호작용 분석을 위한 모델 시스템으로 항체와 항원 상호작용이 사용되었다. 이를 위해 항체 단분자막이 단백질 칩의 기반 물질로서 사용된 PAMAM G4 dendrimer 단분자막 위에 조립되었고, Protein A 분자를 통해 항체 분자들의 방향성이 고려되었다. 항원으로 사용된 BSA는 항체 단분자막 위에서 높은 효율의 결합을 보였고, 비특이적인 단백질의 결합이 최소화되었다. 항체 단분자막에 결합된 BSA는 단백질칩 상에서 직접 효소에 의해 분해된 후 이온화질량분석기를 통해 분석되었다. 우선 효소에 의한 단백질의 분해 시간과 효소와 단백질 간의 비율, 사용된 반응 용액의 조성 등 효소에 의한 단백질의 분해 반응 조건이 최적화되었다. 이러한 방법을 통해 BSA, lysozyme, ferritin 단백질들은 최적화된 조건에서 100fmol 수준까지 검출될 수 있었다. 또한 복잡한 생물학적 혼합물에서 특정 단백질만을 검출할 수 있는 가능성을 알아보았다. 사람 혈청과 단백질 혼합물 내 존재하는 BSA는 0.1 ng/mL 의 농도까지 검출되었다. 한편, E.coli 에서 발현된 특정 단백질들은 칩 상에서의 효소반응 및 이온화질량분석기에 의한 분석의 방법을 통해 세포용해질로부터 검출될 수 있었다.
