Proteome profiling of microorganisms have been carried out to generate valuable knowledge that can be used for the development of metabolic and cellular engineering strategies, which consequently are used to enhance the yield and productivity of native or foreign bioproducts and to modify cellular properties to improve mid-stream and down-stream processes. For these tasks, the proteome profiling by two-dimensional gel electrophoresis technology combined with mass spectrometry have been applied to the development of the strategies for the metabolic and cellular engineering of Escherichia coli and other applications.
First, proteome analysis was carried out to understand metabolic and physiological changes of E. coli during the high cell density cultivation (HCDC). It provided invaluable information in designing metabolic engineering and fermentation strategies for the production of recombinant proteins and metabolites by HCDC of E. coli.
Second, cellular and metabolic perturbation of recombinant E. coil during fed-batch culture for the production of human leptin was understood by proteomes analysis. Based on proteome profiles, highly depressed CysK enzyme during human leptin production was identified and engineered, which finally lead to improved growth of recombinant E. coli and three- to four-fold increase in the productivity of serine-rich recombinant proteins.
Third, proteome profiling of the inclusion body (IB) fraction of recombinant protein produced in E. coil suggested that small heat shock proteins, IbpA and IbpB, are major proteins bound to the lBs. They are essential and play important roles in the production of recombinant proteins in E. coli by protecting recombinant proteins from the degradation by proteases. Based on these findings, two possible applications of IbpA and IbpB in the production of recombinant proteins were demonstrated: (1) enhanced production of recombinant proteins by overexpressing the ibpA and/or ibpB genes and (2) enhanced secretory production of recombinant proteins by knocking-out the ibpAB genes.
이차원 전기영동과 질량분석기를 이용한 대장균의 proteome profiling은 대사 및 세포 공학을 위한 중요한 정보를 제공할 수 있었다.
첫째로, 고농도 배양에서 대장균의 생리학적 변화를 단백질 단계에서 분석하여 대사 및 세포공학적으로 대장균을 개량하기 위한 기초 데이터를 확보할 수 있었다.
둘째로, 축적된 대장균의 고농도 배양시의 핵심효소들의 발현량 변화와 새롭게 구축된 데이터를 바탕으로 재조합 대장균에서의 인체 유래 렙틴 (leptin) 단백질 생산 시스템을 하나의 모델로 하여 프로테옴 분석을 수행하였다. 그 결과 세린계의 아미노산 합성에 관련된 대사경로가 저해되기 때문에 렙틴 단백질의 생산성이 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이와 관련된 효소중에서 cysK 유전자를 증폭하여 대장균의 고농도 배양시 외래 단백질의 specific productivity와 숙주세포의 specific growth rate 감소를 최소화 할 수 있는 시스템을 개발하였다.
셋째로 대장균에서 외래 단백질 대량 생산시 작은 열 충격 단백질(small heat shock proteins)인 IbpA와 IbpB가 외래 단백질에 결합된 주된 단백질들임을 불용성 단백질의 프로테옴 분석을 통하여 알 수 있었다. 또한, 유전자 조작 기술을 통해 IbpA와 IbpB 단백질이 외래 단백질 생산시에 외래 단백질이 프로테이즈에 의해 분해되는 것을 막아 주는 중요한 역할을 수행함을 알 수 있었다. 이러한 IbpA와 IbpB의 기능을 바탕으로 ibpA와 ibpB 유전자를 이용한 새로운 외래 단백질의 제조방법 두 가지를 개발하였다. ibpA 및 ibpB가 결핍된 박테리아를 이용하여 외래 단백질의 분비ㆍ생산 및 활성을 향상시키는 방법과 ibpA 및/또는 ibpB가 증폭된 대장균를 이용하여 세포질 내에 생산되는 외래 단백질의 생산성 향상과 아울러 외래 단백질을 수용성 형태에서 불용성 봉입체로 생산하는 방법을 개발하였다.
