[Part I ] Streptomyces griseus trypsin (SGT) is a bacterial trypsin that lack the conserved disulphide bond surround the autolysis loop. We investigated the molecular mechanism by which SGT was stabilized against autolysis. The autolysis loop connected to another surface loop via salt bridge (Glu146-Arg222) and that the Arg222 residue could also form a cation-π interaction with Tyr217. Elimination of these bonds by site-directed mutagenesis showed that the surface salt bridge at Glu146-Arg222 was the main force in stabilizing enzyme against autolysis. The effect of cation-π interaction at Tyr217-Arg222 itself was little, however, it could make longer the half-life for about five hours and enhance the protein stability over three fold in considering the catalytic activity by the presence of the salt bridge. Melting temperature also showed the cooperation between the salt bridge and the cation-π interaction. These findings showed that S. griseus trypsin was stabilized against autolysis by forming a cooperative network of a salt bridge and a cation-π interaction, which could compensated for the absence of the conserved C136-C201 disulphide bond.
[Part II] Streptomyces griseus trypsin (SGT) shows higher catalytic activity and stability than bovine trypsin. The activity and stability of SGT was investigated in aqueous ethanol for its potential use in organic solvent. Up to 80% ethanol, the catalytic activity of SGT was still higher than that of bovine trypsin measured in water. As ethanol concentration increased, SGT became more reactive to the Lys-containing substrate than Arg-containing substrate, which was resulted from the difference of their $K_m$ values. Calcium stabilized enzyme against autolysis in aqueous ethanol, but it can destabilize when the concentration of ethanol exceeded 80%, in that concentration enzyme lost its activity by the spontaneous denaturation. These phenomena can be explained by the effect of organic solvent to the conformational restriction of enzyme.
스트렙토마이세스 그리세우스에서 분비되는 트립신(SGT) 은 세린계 효소의 하나로 포유류의 트립신과 매우 유사한 단백질이다. Disulphide bond (C136-C201) 는 자가분해 된 효소의 풀림을 방지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 이 단백질은 대부분의 포유류의 트립신과 달리 autolysis loop의 주변에 disulphide bond (Cys136-Cys201)가 없다. 이에 대해 본 연구에서는 어떤 힘들이 SGT의 자가분해를 막고 있는지 밝히고자 하였다. CaPTURE 프로그램과 Protein Explorer를 이용하여 SGT의 구조를 분석한 결과 자가분해 위치에 해당하는 Arg145 바로 옆에 위치하는 Glu146의 잔기가 이웃하는 loop의 Arg222와 이온결합을 하고 있으며, 동시에 Arg222의 잔기는 Tyr217 잔기와 cation-π 결합을 하고 있음을 알 수 있었다. 각각의 결합을 이루고 있는 아미노산을 결합형성이 억제되는 다른 아미노산으로 바꾼 후 활성잔존을 측정하여 보았다. 그 결과 이온결합 (Glu146-Arg222) 과 cation-π 결합 (Arg222-Tyr217)이 상호 협력하여 autolysis loop을 자가분해로부터 보호하고 있음을 알게 되었다.
이 스트렙토마이세스 그리세우스 트립신(SGT)은 활성이 다른 포유류의 트립신보다 매우 큰 것으로 알려져 있다. 또한, 본 연구에서 안정성이 매우 높음도 알 수 있었다. 이러한, SGT의 특성을 이용하여 유기용매내에서의 이용가능성을 알아보기 위하여 에탄올에서의 활성과 안정성을 알아보았다. 그 결과 80 퍼센트의 에탄올에서도 물에서 측정한 bovine trypsin의 활성보다 높은 성질을 유지하고 있음을 알게되었다. 또한, 에탄올의 양이 증가함에따라 효소가 lysine을 가지고 있는 기질을 arginine을 가지고 있는 기질보다 더 효과적으로 반응함을 관찰하였다. 이러한 기질 특이성의 변화는 각 기질의 $K_m$ 값의 차이에 기인한다. 칼슘은 에탄올에서의 효소활성 감소를 저지하는데 상당한 효과를 보이나, 에탄올의 농도가 80 퍼센트를 넘어가면 오히려 활성감소를 촉진시킨 것을 관찰하였다. 이러한 에탄올 농도에 따른 SGT의 활성, 기질 특이성의 변화 및 안정성의 변화는 유기용매의 첨가에 따른 단백질의 conformational restriction으로 설명이 가능하다.
