Schizosaccharomyces pombe $pfh1^{+}$ was isolated as a genetic suppressor of a temperature-sensitive (ts) mutant allele of $cdc24^{+}$ that functions with $dna2^{+}$ in Okazaki fragment processing. We determined enzymatic activities of the Pfh1 enzyme and genetic interactions between $pfh1^{+}$ and $dna2^{+}$. The ts phenotype of dna2-C2 mutant was suppressed when dna2-C2 was combined with pfh1-R20. The double mutant cells still retained the cold-sensitive (cs) phenotype of pfh1-R20. Overexpression of wild type $pfh1^{+}$ in this double mutant cell rescued the cs phenotype of pfh1-R20, but not the ts growth defect of dna2-C2. This result suggests either (1) that an allele-specific interaction between dna2-C2 and pfh1-R20 or (2) that inactivation of $pfh1^{+}$ is required for the rescue of defects associated with dna2-C2. The fact that Pfh1-R20 mutant protein purified displayed significantly reduced ATPase and helicase activities and the pfh1-R23 allele also rescued the ts growth defect of dna2-C2 argues for the latter possibility. The Pfh1 helicase activity was stimulated by fork structure and can use internal ssDNA as entry site. About 10-nt of ssDNA is needed for efficient loading of Pfh1 helicase and longer than 20-nt of ssDNA is no more needed. Pfh1 is not processive helicase and inhibited by RPA. The pol3 and cdc27 mutants (subunits of pol δ) were able to suppress the ts phenotype of dna2-C2 mutant. In contrast, combination of pfh1-R20 with pol3 or cdc27 resulted in synthetic lethal growth. The genetic interactions above suggest that Pfh1 plays a role in collaboration with Dna2 and pol δ during Okazaki fragment processing.
분열 효모의 $pfh1^{+}$ 유전자는 $dna2^{+}$ 와 함께 Okazaki fragment 를 처리하는 기능을 하는 $cdc24^{+}$ 유전자의 고온 민감성 변이주의 유전적 억제자로 발견되었다. 우리는 Pfh1 단백질을 정제하여 효소 활성을 자세히 밝혔고 $pfh1^{+}$ 유전자와 $dna2^{+}$ 유전자간의 유전적 상호작용을 찾아냈다. pfh1-R20 dna2-C2 이중 돌연변이 균주를 만들면 dna2-C2 변이주의 고온 민감성이 억제되어서 37℃ 에서 자랄 수 있고 pfh1-R20와 마찬가지로 낮은 온도에서는 자라지 못한다. 이런 사실은 (1) dna2-C2 와 pfh1-R20 사이에만 나타나는 특별한 상호작용이라는 가설과 (2) dna2-C2 에서 나타나는 결함을 회복하기 위해 $pfh1^{+}$ 이 약화 되어야 한다는 가설로 설명할 수 있다. 이 이중 돌연변이 균주에 wild type $pfh1^{+}$ 을 발현시키면 낮은 온도에서는 자랄 수 있고 높은 온도에서는 자라지 못 한다. 그리고 정제한pfh1-R20 mutant 단백질의 ATPase 와helicase 활성이 wild type 단백질에 비해 매우 줄어들어 있었다. 그리고 pfh1-R23 mutant 도 dna2-C2 변이주의 고온 민감성을 억제하였다. 이상의 사실들로 미루어 볼 때 두 번째 가설이 더 그럴듯해 보인다. 정제한 Pfh1 헬리케이즈 효소는 fork 구조의 DNA를 더 잘 풀었고 양쪽 끝이 모두 막혀있는 ssDNA에도 잘 붙어서 DNA를 풀어내었다. 약 10-nt 이상의 ssDNA 에 효율적으로 붙어서 작용하고 20-nt 이상의 ssDNA 는 더 이상 도움이 되지 않았다. Pfh1 헬리케이즈 효소는 processive하지 않은 헬리케이즈 효소이고 RPA에 의해 방해를 받는다. DNA 폴리머레이즈 δ 의 구성원인pol3 와cdc27 의 mutant 들도 dna2-C2 변이주의 고온 민감성을 억제하였다. 그리고 pfh1-R20 pol3 와pfh1-R20 cdc27 이중 돌연변이 균주는 자라지 못했다. 이상의 결과들을 종합해서 Pfh1이 pol δ 와 함께 긴 5’flap 을 만들고 Dna2가 Cdc24와 함께 이것을 제거한다는 새로운 모델을 제안한다.
