Many physiological and behavioral systems are controlled by an internal self-sustained molecular oscillating mechanism with a periodicity of approximately 24 hours, known as the biological clock. This self-sustaining clock exists in animals, plants and even in bacteria and adjusted by the alternating of the day and night of the earth's cycle. This biological rhythms that persist under constant conditions and has a periodicity of - 1 day is called "circadian"(cirda "around"; dian, "day"). This clock system have the cell-autonomous, genetically-based biological propertues with which to respond appropriately to daily changes in environmental stimuli, the most important of which is the light-dark cycle. To understand most remarkable feature of clock gene; circadian oscillation, we made mPer2 real time reporting system by making mPer2:luciferase functional knock-in mice and identified a noncanonical E-box enhancer sequence in the 5'-UTR of the mPer2 gene and used this sequence to drive the circadian expression of luciferase in transgenic mice. mPer2:luciferase functional knock-in mice showed persistent oscillation of bioluminescence with ca. 24 hours of period. Behavior analysis of mPer2:luciferase mouse showed normal behavior compare to same littermate wild type mouse. We demonstrate that the E-box enhancer: luciferase transgenic line and the mPer2: Luciferase knock-in line allow us to monitor in real-time the transcriptional and translational profiles, respectively, of the mPer2 gene in explanted SCN and peripheral tissues. SCN and peripheral tissues showed robust and self-sustained sustained circadian rhythms of mPer2 expression with only slight damping in static explant cultures for up to 20 days. Furthermore, in SCN-lesioned knock-in animals, a persistent circadian oscillation in bioluminescence in peripheral tissues was obserbed, yet from tissue to tissue within each animal and among animals there is a loss of phase coordination. Contrary to previous studies, we propose that peripheral tissues have autonomous, self-sustained, circadian oscillators, and that the role of the SCN in relation to the peripheral clocks is not one of pacemaker driving circadian oscillations, but rather one of phase coordinator.
청록색 세균류 (Cyanobacteria) 에서부터 포유류 (Mammal) 에 이르는 계통학상으로 다양한 지구상의 생물체들이 내생적이고 (endogenous), 세포 자율적인 (cell-autonomous) 유전적인 생체 시계(genetically-based biological clock systems)를 가지고 있다. 이 생체 시계를 통해서 생물체는 광주기나 온도변화등의 매일일어나는 환경변화에 가장 효과적으로 대응하며 살고 있다. 셍체시계의 가장 특징적인 정은 외부의 변화나 자극으로부터 격리되어있어도 스스로 24시간 주기를 유지할수 있다는 점이다. 생체시계는 아래의 세가지 특징으로 설명 되어질수 있다. 1) 입력 경로 를 통해 광수용체 (photoreceptors)가 빛을 중앙 시계(central clock)로 전달하는 경로, 2) 페이스 메이커 인 중앙시계가 photic stimuli에 의해 훈련되어지는 과정 (entrainment), 3) 페이스 메이커가 만들어내는 출력 시그날에의해 유전적, 생리적, 행동적인 biological rhythms을 조절 하는 단계이다. [Takahashi, 1995; Eskin, 1979].
Circadian 유전자의 가장 특징적인 성질이 되는 circadian oscillation 보다 정확하게 이해하기 위해서 우리는 대표적인 clock gene 중의 하나인 쥐 피어리어드2 유전자의 real-time monitering system를 knock-in 이라는 gene targeting 방법중의 한가지를 이용하여 만들었다. Luciferase 유전자가 mPer2 유전자 exon 23번의 뒤에 같은 frame으로 연결되어있는 이 model system 은 endogenous mPER2의 기능을 불활성 시키지 않으면서 mPER2 의 발현을 실시간으로 리포팅할수 있게 해주는 것이 형질전환 동물의 동물 행동 테스트와 조직의 luciferse real-time monitering으로 검증 되었다. Central clock 인 SCN 이외의 조직에서도 20일 이상의 지속적인 oscillatory rhythm 이 관찰된것으로 미루어 peripheral tissue가 slave oscillator 가 아닌 self sustained oscillator 일 가능성을 생각해 볼수 있었다. mPer2 유전자의 5' 전사조절부위에서 noncanonical E-box (-20 to -15)를 발견하었다. 이 noncanonical E-box (E2) 는 core sequence 가 ARNT binding site 와 동일하였으며 그 주변 서열은 MOP3/MOP4 dimer binding site와 유사 하였다. CACGTT 를 GCTAGT 로 mutagenesis 시킨결과 mCLOCK/mBMAL1에 의한 transactivation effect 가 완전히 소멸되었다. DNaseI hypersensitivity assay 결과 E2 sequence 가 ative transcription regulatory region 에 위치하고 있는 것을 in vivo 에서 확인할수 있었다. Gel mobility shift assay 를 통해서 mBMAL1 이 E2 와 단백질-DNA specific complex를 만드는 단백질중의 하나임을 밝히었다. 이 E2 서열을 포함하는 -112 to +98 위치의 mPer2 5' upstream 전사 조절부위를 이용해 luciferase 를 드라이브하는 transgenic mouse model을 만들음으로서 E2가 target gene의 circadian transcription을 일으키는 E-box 의 조건을 만족하는 cic-element임을 확인 하였다.
$mPer2^Luc$ knock-in line 과 E2 trangenic line 의 luciferase activity 의 phase and period 를 비교함으로서 mPer2 gene 의 transcription 과 translation 의 관계와 circadian rhythms 를 profiling 하였다. E2 enhancer transgenic 동물의 SCN tissue 에서 luciferase bioluminescence 는 late subjective day에 가장 높게 나타났으며, $mPer2^Luc$ knock-in 동물에서는 약 3-4 시간 뒤에 peak 가 나타났다. 이것은 E2-enhancer transgenic 동물에서 luciferase activity 가 endogenous mPer2 RNA rhythms을 나타내고, knock-in 동물에서는, luminescence 가 mPER2 단백질 발현을 나타내주는것으로서 기존에 보고된 circadian 유전자들의 transcription-translation delay를 실제의 모델동물에서 보여주는 예가 된다. 예상했던데로 peripheral tissues 에서의 luminescence는 SCN에서 보다 지연되었으며 이러한 현상은 E2 enhancer transgenic 동물과 $mPer2^Luc$ knock-in 동물에서 동일하게 관찰 되었다.
SCN-lesion 이 $mPer2^Luc$ mouse 의 behavior를 완전이 arrhythmic하게 만든것에 반하여, lesioned mice의 tissue explant에서는 지속적인 luciferase activity의 circadian oscillation 이 관찰 되었다. 그러나 rhythms 의 phase는 LD 혹은 DD 의 wild type control에 비교하여 유의 수준검정결과 의미있게 분산되어있는 것이 관찰 되었다. 따라서 circadian system 에서 SCN 의 기능이 driver 가 아닌 coordinator 로서 다시 고찰 되어져야함을 제시한다.
