We identified a novel helicase in humans that belongs to members of superfamily I helicase, and found that it contains a well-conserved F-box motif at its N-terminus, and named the enzyme hFBH1 (human F-box DNA Helicase 1). A recombinant hFBH1 containing glutathione-S transferase at the N-terminus was expressed in Sf9 cells and purified. We show that the hFBH1 exhibited DNA-dependent ATPase and DNA unwinding activities that unwinds duplex DNA in the 3’ to 5’ direction. The hFBH1 enzyme interacted with human SKP1 and formed an SCF (SKP1/Cullin/F-box) complex together with human Cullin. The $SCF^{hFBH1}$ complex, immunoprecipitated from cell extracts, catalyzed polyubiquitin formation in the presence of the ubiquitin-activating and ubiquitin-conjugating enzymes, E1 and E2, respectively. We also describe the purification and enzymatic properties of the recombinant $SCF^{hFBH1}$ complex from insect cells expressing hFBH1, SKP1, CUL1, and ROC1. The $SCF^{hFBH1}$ complex was purified as a single tight complex that retained DNA helicase, DNA-dependent ATPase, and ubiquitin ligase activities. The helicase and ATPase activities residing in the $SCF^{hFBH1}$ complex were indistinguishable from those of the protein hFBH1 alone. Moreover, the ubiquitin ligase activity of the $SCF^{hFBH1}$ complex was hardly affected by single-stranded or double-stranded DNA. In addition taking advantage of biochemical fractionation, we found out UbcH5a and UbcH5c as stimulating factors of ubiquitin ligase activity of $SCF^{hFBH1}$ complex. This stimulation was dependent on cdc34 and required ubiquitin available 48 lysine residue. We demonstrate that hFBH1 is the first F-box protein that has its own intrinsic enzyme activity. The multiple activities present in this complex act independently of each other, suggesting that the $SCF^{hFBH1}$ complex can catalyze a ubiquitination reaction while it acting as a DNA helicase or translocating along DNA. The potential role of the $SCF^{hFBH1}$ complex in DNA metabolism based upon the enzymatic activities associated with this complex are discussed.
1997년 journal of Biological chemistry에 발표한 논문에서 Schizosacharomyces pombe DNA helicase 1 을 정제하고 생화학적 특성을 규명하였다. 이 S. pombe DNA helicase 1 의 human homologue를 BLAST search 를 통해 sequence 를 확인하고 cloning 하였다. Cloning 된 gene 은 969개의 아미노산을 coding하고 잘 보존된 7개의 helicase domain 뿐만 아니라 N-terminal 부분에 F-box motif 라는 특이한 아미노산 서열을 가지고 있었다. 이제 까지 알려진 F-box domain을 가지고 있는 단백질은 SKP1, CUL1, ROC1 과 함께 SCF complex를 이룬다고 보고 되었다. SCF complex 는 ubiquitination 의 마지막 단계인 ubiquitin ligase (E3) 를 수행함으로써 세포내 특정 단백질을 polyubiquitination 시키게 된다. Polyubiquitination 된 단백질은 26S proteasome 에 의해 제거되는데, 이런 단백질의 제거는 세포내 다양한 분야에서 필수적인 역할을 하게 된다. 우리는 이 human helicase를 human F-box DNA helicase 1 (hFBH1)이라고 명명하였다. hFBH1 은 예상한 바와 같이 F-box domain에 의존적으로 SKP1, CUL1, ROC1 과 함께 $SCF^{hFBH1}$ complex를 이루었다. 실제로 DNA 이중나선을 푸는 helicase 활성을 가지고 있는 지 알아보기 위해 baculovirus system을 사용하여 단백질을 정제하였다. 정제된 hFBH1 은 single strand DNA 의존적인 ATP 분해 활성과 helicase 활성을 가지고 있었다. hFBH1이 SCF complex를 이루고 있을 때는 helicase 활성과 ATP 분해 활성이 어떻게 달라 질지 확인하기 위해 $SCF^{hFBH1}$ complex를 정제 하였다. 정제된 $SCF^{hFBH1}$은 monoubiquitin 을 polyubiquitin 으로 바꾸는 ubiquitin ligase 활성을 가지고 있었다. 또한 이 ubiquitin ligase 활성은 helicase 활성을 나타낼 수 있는 DNA 가 존재 할 때도 전혀 영향을 받지 않았다. $SCF^{hFBH1}$ 은 ATP 분해 활성과 helicase 활성에 대해서 hFBH1 과 동일했다. SKP1을 비롯한 다른 단백질이 결합은 hFBH1의 helicase 활성과 ATP 분해 활성에는 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다. 또한 생화학적 fractionation을 이용해서 UbcH5a 가 $SCF^{hFBH1}$ 의 ubiquitin ligase 활성의 activator이란 것을 알게 되었다. Ubiquitin conjugating enzyme (E2)의 한 종류인 UbcH5a는 SCF ubiquitin ligase의 이미 알려진 E2인 cdc34 함께 polyubiquitin 을 합성하는데 있어 상승작용을 하였다. 이런 생화학적 성질들을 종합해 볼 때 $SCF^{hFBH1}$ complex는 duplex DNA를 single strand로 풀거나 DNA 상에서 움직일 때 E3 ubiquitin ligase로 역할을 수행할 수 있다는 것을 의미한다.
단순히 protein-protein 결합 domain 만을 가지고 있는 알려진 다른 F-box protein 과 다르게, hFBH1은 처음으로 발견된 효소적 활성을 가진 F-box protein 이다. hFBH1는 자신의 helicase 활성을 이용하여 ubiquitin ligase 로 작용하면서 역동적으로 DNA 가닥을 움직이면서 할 일이 끝난 단백질을 분해하여 일을 마무리 지을 수 있을 것이다. 만약 hFBH1이 ubiquitination 시키는 기질을 찾는 다면 세포내에서 hFBH1의 역할을 더 정확히 알 수 있을 것이다. 또한 그 기질이 어떠한 생물학적 과정에 관여하는 지에 따라 다양한 역할을 수행할 수 있을 것이다.
