We have developed an enzyme-linked electrochemical method to detect biomolecular recognitions including protein-ligand interaction and DNA hybridization. A partially ferrocenyl-tethered poly(amidoamine) dendrimer (Fc-D) was used as an electrocatalyst to enhance the electronic signals of biomolecular recognition as well as a building block to immobilize biomolecules. Alkaline phosphatase was acted as a generator of electroactive species for the electrochemical detection.
The biospecific interaction of avidin to biotin-functionalized Fc-D layer was detected by the subsequent association with biotinylated alkaline phosphatase, which led to the conversion of electroinactive substrates to electroactive products by the enzymatic reaction. The electroactive products diffuse near the layer of Fc-D. When the ferrocene is electrochemically oxidized, the electrooxidized ferricenium ion accepts electrons from enzymatic products and returns to the ferrocene of the reduced form. In other words, the electrocatalytic reaction occurs, which results in enhancing the electrochemical response of enzymatic product. Using electrochemical quartz crystal microbalance (EQCM), the mass change of enzymatic substrates such as paminophenyl phosphate and a-naphthyl phosphate was simultaneously investigated during each electrochemical oxidation. Detection limit of this method is about 0.3 ㎍/mL of avidin. Furthermore, the alternating multilayered assembly composed of avidin and biotinylated alkaline phosphatase was constructed and investigated with surface plasmon resonance and cyclic voltammetry experiments.
In DNA hybridization sensing, thiolated capture probe was attached to the remaining amine groups of Fc-D on the SAM via a bi-functional linker. The target DNA was hybridized with the capture probe and an extension in the DNA of target was then hybridized with a biotinylated detection probe. Avidin-conjugated alkaline phosphatase was bound to the detection probe and allowed to generate the electroactive label, p-aminophenol from p-aminophenyl phosphate enzymatically. p-Aminophenol diffuses into the Fc-D layer and is then electrocatalytically oxidized by the electronic mediation of the immobilized Fc-D, which leads to a great enhancement in signal. Consequently, the amount of hybridized target can be estimated using the intensity of electrocatalytic current. This DNA sensor exhibits the detection limit of 20 fmol. Our method was also successfully applied to the sequence-selective discrimination between perfectly matched and single-base mismatched target oligonucleotides.
단백질이나 DNA 와 같은 생체물질을 분석할 수 있는 새로운 전기화학 측정법을 개발하였다. 이 방법에선, 전기활성을 갖는 ferrocene이 달려있는 dendrimer (Fc-D) 를 생체물질을 전극에 고정하기 위한 연결분자로 사용하면서, 동시에 생체물질 인식에 대한 전기적 신호를 증가시켜주는 전기촉매로 이용하였다. 또한, alkaline phosphatase 는 전기화학 측정을 위해 전기활성을 갖는 화합물을 생성하는 표지 효소로 사용되었다.
새로운 전기화학 측정법을 이용해, avidin과 biotin사이의 특이결합을 분석해 보았다. 우선, Fc-D 의 끝을 avidin이 선택적으로 결합할 수 있도록 biotin 기능기로 변환시킨 후, 선택적으로 표면에 결합된 avidin은 biotin이 붙어있는 alkaline phosphatase (B-ALP) 와 순차적으로 결합하게 하였다. 결합한 효소 반응에 의해 생성된 전기활성을 갖는 화합물이 전극 쪽으로 확산해 들어오게 되며, 이때 전기화학적으로 산화된 ferricenium ion이 그 화합물로부터 전자를 빼앗아 산화시키면서, 자신은 다시 ferrocene으로 되돌아 가는 촉매반응이 일어나게 된다. 이러한 촉매반응에 의해 흐르는 전류를 이용해 biotin과 avidin 사이 특이결합을 측정하였고, avidin의 측정 한계 농도는 약 0.3 μg/mL 으로 나타났다. 한편, 전기화학적 수정 미세저울 (Electrochemical quartz crystal microbalance, EQCM) 을 이용해 효소의 두 가지 기질인 p-aminophenyl phosphate와 α -naphthyl phosphate에 대한 전기화학 반응과 질량변화를 동시에 살펴보았다. 더불어, Avidin과 B-ALP로 교차되어 이루어진 다층구조 형성 과정을 순환전압전류법 (cyclic voltammetry, CV) 와 표면 플라즈몬 공명 분광법 (surface plasmon resonance spectroscopy, SPR) 을 이용해 관찰 하였다.
새로운 전기화학측정법을 DNA hybridization 측정에도 이용해 보았다. 우선, 고정화된 Fc-D의 끝에 thiolated capture probe를 붙여, 측정하고자 하는 target DNA를 선택적으로 붙잡도록 하였다. 결합한 target DNA는 biotin이 달려있는 detection probe와 avidin이 붙어있는 alkaline phosphatase의 순차적인 결합을 통해 생성된 전기화학적으로 촉매화된 전류로 분석하였다. 결과적으로, 이러한 전류를 통해, 한 개의 base가 어긋난 정도까지 측정할 수 있었고, 측정 제한 농도는 약 20 fmol로 측정되었다.
