Metabolic engineering studies for the production of polyhydroxyalkanoate (PHA) in Escherichia coli have been carried out. For these tasks, metabolic pathways of E. coli including glycolytic pathway and fatty acid β-oxidation pathway have been engineered to support PHA production.
At first, poly(3-hydroxybutyrate) [P(3HB)], a member of short-chain-length (SCL) PHA was efficiently produced by the amplification of triosephosphate isomerase (TpiA) or fructose-bisphosphate aldolase (FbaA) enzyme, which were previously identified by proteome analysis of E. coli XL1-Blue producing P(3HB).
Secondly, β-oxidation pathway was metabolically engineered to supply medium-chain-length (MCL) PHA precursors. MCL PHA enriched in the specific monomers could be produced by the amplification of FadD and FadE enzymes in the recombinant E. coli strains deficient in the FadA and/or FadB. Also, amplification of FabG enzymes in fadA mutant E. coli strain supported the production of MCL PHA enriched in the specific monomer. Enhanced production of MCL-PHA from fatty acid was achieved by the amplification of FadB homologous enzymes. These enzymes include YfcX, PaaF, PaaG, and YdbU. A new enoyl-CoA hydratase MaoC involved in the production of MCL PHA in fadB mutant E. coli strain was identified and characterized. Enzymatic and genetic analyses revealed that MaoC enzyme constructs the metabolic link between beta-oxidation pathway and PHA biosynthetic pathway when the FadB is removed.
Thirdly, PHA consisting of SCL and MCL monomers could be produced. Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) [P(3HB-co-3HHx)] was produced from fatty acid by the expression of Aeromonas PHA synthase and enoyl-CoA hydratase genes. Also, terpolymer PHA consisting of 3HB, 3-hydroxyvalerate (3HV), and 3HHx could be produced by supplying odd-carbon-number fatty acid and lauric acid concomitantly. Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyalkanoate) [P(3HB-co-3HA)] was produced from fatty acid by the expression of Pseudomonas sp. 61-3 phaC2 gene and Ralstonia eutropha phaAB genes in fad mutant E. coli strains. Supplying gluconate significantly increased the fraction of 3HB in copolymer PHA.
Polyhydroxyalkanoate (PHA) 의 생물학적 생산을 위하여 재조합 대장균을 대사공학을 통해 개량하였다.
첫째로, poly(3-hydroxybyttrate)[P(3HB)]을 대장균의 포도당 분해회로의 효소중에서 Fba와 TpiA 효소의 증폭을 통하여 효율적으로 포도당으로부터 생산할 수 있었다.
둘째로 지방산 분해회로의 대사공학적 조작을 통해 중간사슬길이 (medium-chain-length, MCL)의 PHA를 생산할 수 있었다. 지방산 분해에 관여하는 효소 중 FadA와 FadB 하나 혹은 그 두개가 모두 제거된 대장균에서 FadD와 FadE 효소의 증폭을 통하여 특정 모노머가 높은 분율로 함유된 중간사슬길이의 PHA를 생산할 수 있었다. 또한 FadA가 제거된 대장균에서 FabG 효소의 증폭을 통하여 특정모노머가 높게 함유된 중간사슬길이의 PHA을 생산할 수 있었다. 재조합 대장균에서 FadB와 유사한 효소 YfcX, PaaF, PaaG, YdbU의 증폭을 통하여 중간사슬길이의 PHA의 생산성을 높일 수 있었다. 또한 FadB가 제거된 대장균에서 PHA 합성에 관여하는 새로운 enoyl-CoA hydratase인 MaoC를 찾고 그 특징을 분석하였다.
셋째로 짧은 사슬길이 (SCL) 모노머와 중간사슬길이 모노머가 동시에 함유된 PHA를 생산하였다. Aeromonas로 부터 유래된 PHA 합성유전자와 enoyl-CoA hydratase 유전자의 증폭을 통하여 탄소수가 4개와 6개인 모노머로 구성된 PHA를 lauric acid로부터 합성할 수 있었다. 또한 탄소수가 홀수개인 지방산과 짝수개인 지방산을 동시에 탄소원으로 사용하여 탄소수가 4개, 5개, 6개인 모노머로 구성된 terpolymer PHA도 합성할 수 있었다.
FadA와 FadB 하나 혹은 그 두개가 모두 제거된 대장균에서 Pseudomonas sp. 61-3으로부터 얻어진 PHA 합성유전자와 Ralstonia eutropha로부터 얻어진 phaAB 유전자의 증폭을 통하여 decanoic acid로부터 탄소수가 4개, 6개, 8개, 10개인 모노머로 구성된 PHA를 합성할 수 있었다. 또한 gluconate의 첨가를 통하여 탄소수가 4개인 모노머의 비율을 높일 수 있었다.
