Developing high cell density culture technologies has attracted a lot of attentions as it may guarantee a high product level, which has a significant effect on the product separation processes and the production cost. In large-scale aerobic fermentation processes, however, a high cell density generally could not be achieved due to the oxygen limitation. In this study, high purity oxygen was employed to eliminate the oxygen limitation and to investigate the potential influences of high purity oxygen on fermentation processes. Two important microorganisms, Ralstonia eutropha for producing poly(hydroxyalkanoate) and recombinant E. coli BL21 (DE3) for producing human growth hormone (h-GH), were cultivated in the 5-L, 30-L, and 300-L fermentors with air and high purity oxygen, respectively. It was found that the supply of high purity oxygen could eliminate the oxygen limitation efficiently, and could enhance the cell densities and product levels much in the two model culture systems. No microbial metabolism shift except for the increase in cell density was expected due to the supply of high purity oxygen.
Compared to the results found in fed-batch cultures of R. eutropha with air supply, the final dry cell weight (208.2 g/L) and PHB concentration (138.7g/L) obtained with high purity oxygen in the 5-L fermentor increased 2.2 and 2.9 times, respectively. In the 30-L fermentor, they increased 3.8 and 6.2 times, respectively. And only 8.4g/L of PHB was produced in the 300-L fermentor with air supply. This clearly showed the impact of oxygen supply on the high cell density culture, especially in the large-scale fermentation process.
It was confirmed that a high $CO_2$ concentration could inhibit the cell growth and PHB synthesis in the culture of R. eutropha, even though it is one of autotrophic microbes and can use $CO_2$ as the main carbon source to produce PHB. We developed a new technique for studying $CO_2$ inhibition on the fermentation, “the natural or autogenous $CO_2$ method” by varying pure oxygen supply rate to make it possible to place microbial cells under different process $CO_2$ concentrations without injecting artificial $CO_2$. This method will serve as the estimation tool for $CO_2$ effect in a real fermentation process.
Glucose concentrations affected the cell growth and PHB synthesis severely in the cultures of R. eutropha. In the 40 h fermentations, 322g PHB was with glucose at 9 g/L, whilst only 200g PHB was produced in the case of 40g/L. A mathematic model was developed for fed-batch cultures of R. eutropha with phosphate limitation. A very good agreement was found between the simulation values and experimental data.
The production of h-GH by high cell density cultures of recombinant E. coli BL21 harboring human growth hormone genes was investigated. At 27℃, most expressed rh-GH was soluble. However, at the optimal temperature (37℃) for cell growth, only was a few part of rh-GH expressed in soluble forms. While the highest rh-GH concentration (4.9g/L) was obtained in the 5-L cultivation with high purity oxygen supply, the rh-GH concentration (4.0g/L) in the 30-L cultivation with high purity oxygen supply increased 3.6 times of that with air supply. This was mainly attributed to the increase of cell density by supplying high purity oxygen.
In order to improve the oxygen utilization ratio, fed-batch cultures were successfully performed by recycling the unused oxygen with VPSA. The new proposed fermentation system coupled with two VPSA (Vacuum Pressure Swing Adsorption), one for producing high purity oxygen from air and another for recycling the unused oxygen, provided a potential way to carry out high cell density cultures in large-scale processes.
These results shows that supplying high purity oxygen can eliminate the oxygen limitation efficiently to attain a high cell density and a high productivity in aerobic fermentations, especially in large-scale processes. The regeneration and reutilization of the unused oxygen with the new proposed fermentation system coupled with two VPSA can increase the oxygen utilization ratio much, and make sure that the high cell density cultures with high purity oxygen can be carried out economically. With the industrialization of this technique, we are expecting that a new era “high purity oxygen culture” will start soon.
미생물의 고농도 배양 기술을 개발하는 것은 발효 산물의 생산 및 분리 비용을 줄이는 데 큰 영향을 끼치므로 현재 각광받고 있다. 그러나 큰 규모의 호기성 발효공정의 경우, 용존산소 농도의 제한 때문에 미생물의 고농도 배양은 일반적으로 불가능하다. 본 연구에서는 용존산소 농도의 부족현상을 줄이고 발효공정에 고순도의 산소가 미치는 잠재적인 영향을 탐구하기 위해 고순도의 산소를 발효공정에 적용하였다. Poly(hydroxyalkanoate)를 생산하는 Ralstonia eutropha 와 human growth hormone (h-GH)을 생산하는 재조합 대장균 BL21 (DE3) 의 두 가지 균주를 사용하여 각각 5L, 30L, 300L 발효조에서 공급기체를 공기와 고순도의 산소로 바꾸어 가며 발효실험을 수행하였다. 그 결과, 고순도의 산소를 이용한 발효의 경우 산소부족현상을 효과적으로 해결했으며 고농도, 고생산성 배양을 이룰 수 있었다. 고순도의 산소를 공급함으로써 생기는 미생물 대사회로의 전환은 발견되지 않았다.
고순도의 산소를 공급기체로 사용할 때, 세포건조질량은 208.2g/L, PHB 농도는 138.7g/L 가 달성되어 공기를 공급기체로 사용한 R. eutropha 의 5L 발효조에서의 유가식 배양결과와 비교할 때 각각 2.2배, 2.9배 증가한 결과를 보였다. 30L 발효조에서의 실험에서는 각각 3.8배, 6.2배 증가한 결과를 보였다. 그리고 300L 발효조에서 공기를 공급기체로 사용한 경우 단지 8.4 g/L의 PHB를 얻을 수 있었다. 이 결과를 통해 특히 큰 규모의 호기성 발효공정에서 고농도 배양에 끼치는 산소공급의 중요성을 알 수 있다.
R. eutropha의 배양을 통해 이산화탄소를 PHB를 생산하기 위한 탄소원으로 사용하는 자가영양생물의 경우에서도 높은 농도의 이산화탄소 농도는 균주성장을 저해한다는 결과를 얻었다. 본 연구에서는 발효공정에 쓰이는 순수산소의 공급속도를 조절해 대상 미생물이 서로 다른 이산화탄소 농도가 포함된 환경에서 성장할 수 있게 함으로써 이산화탄소 농도의 균주성장 저해를 보다 효과적으로 연구할 수 있는 새로운 기술을 개발하였다. 이 기술을 이용하여 실제 발효공정에서 이산화탄소의 영향을 효과적으로 예측할 수 있다.
R. eutropha을 이용한 발효에서는 포도당 농도가 균주 성장과 산물인 PHB 합성에 큰 영향을 미친다. 40시간 동안 발효를 진행한 결과, 9g/L 포도당 농도를 포함한 경우 322g 의 PHB가 생산되었지만 40g/L 포도당을 포함한 경우 200g의 PHB가 합성되었다. 그리고 인산 농도의 저해를 고려한 R. eutropha의 유가식 배양에 대한 수학적 모델을 결정하였다. 모델에서는 실험값과 시뮬레이션 값이 좋은 일치를 보였다.
인간 성장 호르몬(rh-GH) 을 생산하는 재조합 대장균 BL21을 고농도로 배양하는 연구를 수행하였다. 27℃ 에서는 대부분의 rh-GH는 물에 용해된다. 그러나 세포 성장에 최적인 37°C에서는 소량의 rh-GH만이 물에 용해된다. 5L 발효조에서 고순도의 산소를 공급해서 발효한 결과 가장 높은 농도인 4.9g/L의 rh-GH를 얻을 수 있었고, 30L 발효조에서 고순도의 산소를 공급하면서 배양한 결과 공기를 공급하면서 발효한 것에 비해 3.6배 증가한 4.0g/L의 rh-GH를 얻을 수 있었다. 이와 같은 산물의 증가는 고순도의 산소공급을 통한 세포농도의 증가로 인한 결과이다.
배양 중 산소 사용률의 향상을 위해 VPSA(Vacuum Pressure Swing Adsorption) 를 통한 사용되지 않은 산소의 재순환 과정을 거친 유가식 배양을 성공적으로 수행하였다. 2개의 VPSA와 결합된 새로운 발효공정을 제안하여 실험을 수행하였다. 이 공정에서 사용한 2개의 VPSA 중 하나는 공기에서 고순도의 산소를 생산하기 위한 장치이고 다른 하나는 미사용된 산소를 재순환하기 위한 장치로서, 2개의 결합된 VPSA 장치는 고순도의 산소공급을 통한 대규모 고농도 발효공정을 실현하기 위한 가능성을 보여 준다.
본 연구에서는 대규모 발효공정을 비롯한 전반적인 호기성 발효에서 효율적으로 고농도 및 고생산성 배양을 달성하기 위해 고순도의 산소를 공급함으로써 산소농도 저해현상을 최소화시키는 결과를 얻었다. 2개의 VPSA와 결합된 새로운 발효공정을 통해 미사용된 산소를 재순환 및 재사용함으로써 산소의 사용률을 크게 높일 수 있었고, 결과적으로 고순도의 산소공급을 통한 고농도 배양을 경제적으로 달성할 수 있었다. 이 기술의 산업화를 통해 “고순도 산소를 이용한 배양” 의 새로운 시대가 열릴 것이 기대된다.
