The initiation mechanism of the recognizing a damaged DNA was the key issue in the Nucleotide Excision Repair (NER) pathway. Several studies have found that damaged DNA was first recognized by XPC-hHR23B proteins. XPC-hHR23B complex enhanced the binding activity to the damaged DNA than the XPC alone. The functionally characterized XPC-binding domain of hHR23B(277-332) has been identified in vitro NER reaction. In this study the structure of hHR23B(275-342) was first solved with heteronuclear triple resonance NMR spectroscopy. To bock the aggregation of XPC binding domain of hHR23B(277-332), N-terminally 3 residues and C-terminally Gly-rich loop was additionally expanded in cloning strategy. For the 3D NMR structure study, 1mM hHR23B(275-342) was concentrated and 10mM CHAPS must be added for the blocking from the non-specific interactions among the samples or from oligomerization. The solution structure of XPC binding domain of hHR23B shows that 4 helical bundles which have tightly interacted with hydrophobic core residues. The conserved amino acids of XPC binding domain between hHR23B, hHR23A and hPLICs revealed that most Pro residues shows structurally expected characters to make helix kinked and turned. Two hydrophobic surfaces were also detected with electrostatic potential surface analysis in the structure of XPC binding domain of hHR23B. One of two or both of them would be served as the directly interaction surface with XPC. Additionally with the N-terminally helix favorable domain (Helix 0) with hydrophobic patch between Helix 1, 2, 3 region will be involved in the XPC binding mode. Relaxation study of the XPC binding domain of hHR23B show that four helices are rigid but N-terminal helix favorable residues show anisotropic internal motion. Between the Helix0 and Helix 1 parts, XPC binding domain of hHR23B has more flexible and turn motion. From this dynamics characters the Helix 0 and Helix 1 could stimulate the DNA binding mode of XPC. From the Dali server results we can get none of the protein has structurally homology with XPCB over the Z values 3. From the sequence multiple alignment data and PDB homology search results we can concluded that the XPCB is the new folding domain in proteins which has ubiquitin like domain (UbL ) and ubiquitin associated domains.
생체 내 단백질이 손상된 DNA를 최초로 인식하는 것은 손상된 DNA를 정상으로 회복시키는 메커니즘에서 매우 중요하다. 그 동안 많은 연구를 통해 XPC-hHR23B 결합체가 손상 DNA를 최초로 인식하는 단백질임이 밝혀져 왔다. XPC-hHR23B 결합체는 XPC 단독으로 존재할 때보다 손상된 DNA에 결합하는 능력을 향상시키는 것으로 보고되어져왔다. XPC와 결합하는 hHR23B의 영역인 아미노산 277번부터332번은 In vitro에서도 hHR23B 단백질 전체와 마찬가지로 XPC와 결합을 보이고 또한 손상된 DNA의 인식력을 높여주고 손상된 DNA의 회복을 도와주는 것이 밝혀졌다. 본 연구는 XPC에 결합하는 hHR23B영역을 포함하는 hHR23B(275-342) 부분을 heteronuclear triple resonance NMR 방법을 통해 최초로 삼차원 구조 분자구조를 밝혀내었고 Relaxation실험을 통하여 그 동력학적 특성과 XPC 단백질에 결합하는 부위를 밝혀보고자 하였다. hHR23B의 XPC에 결합하는 부위는 상당히 hydrophobic한 특성을 갖고 있어서 아미노기(N-terminal)에 3개의 아미노산을 늘리고 카르복실기(C-terminal)에 Gly이 많은 부분 10개의 아미노산을 추가하여 hydrophobic한 Residue들이 포함되도록 E.coli에서 발현하였다. 정제된 단백질은 1mM 이상 농축하였을 때 NMR Spectrum이 구조를 연구하기 부적합 결과를 보였다. 이에 일반적으로 생물학적 기능에 영향을 주지 않는 10mM CHAPS를 사용하여 hHR23B(275-342)의 3차원 NMR 실험을 수행할 수 있었다. NMR spectrum을 분석하여 구한 단백질의 구조는 hydrophobic residues로 단단하게 결합된 4개의 Helix로 이루어졌으며 2차 구조의 예측에서 Helix로 결과가 나온 N-terminal의 영역이 helix favorable하게 관찰 되었다. XPC에 결합하는 것으로 예상되는 크게 2개의 hydrophobic한 영역이 관찰되었고 추가로 Relaxation실험을 통하여 Helix-1. Helix-2영역(A영역)은 Order parameter S2 이 0,94이상으로 내부움직임이 거의 없었으며 N-terminal Helix-0 부위, Helix-2와 Helix-3 연결부위, 그리고 Heix-3과 Heix-4 연결부위( B 영역)는 anisotropic하게 빠른 내부움직임을 보였다. hHR23B(275-342)의 동역학적 특성을 통해 XPC와 hydrophobic interaction을 하는 부위는 A영역일 것이라는 가설을 만들 수 있었다. 본 연구의 결과인 XPC에 결합하는 hHR23B의 삼차원 구조와 동역학적 특성을 바탕으로 생물학적 mutation실험을 한다면 보다 적은 노력으로 XPC을 결합부위를 정확히 밝힐 수가 있을 것이며 또한 그 분자생물학적 기능을 원자수준에서 설명할 수 있을 것이다. 또한 본 연구에서 구한 XPC결합하는 hHR23B(275-342)의 삼차원 구조는 Dali Server를 통한 유사한 구조를 Protein Data Bank에서 찾아보았을 때 기존의 구조가 알려진 단백질과 아미노산 sequence 유사성과 구조의 유사성이 거의 없는 (sequence homology ＜20%, Z value＜3) 결과를 보여주었다. 이를 통해 XPC에 결합하는 hHR23B(275-342)는 새로운 구조적 특성을 갖고 있다는 것을 밝힐 수 있었다.
