The yeast, Pichia ciferrii has been known to produce large quantities of sphingoid bases, which are secreted into extracellular medium as acetylated bases. These secreted bases consist mostly of tetraacetyl phytosphingosine (TAPS), which is a precursor of sphingolipid synthesis. We have developed an integrative transformation system for improvement of the yield of TAPS and production of other sphingoid bases in the P. ciferrii by metabolic engineering. Ribosomal protein L41 gene of P. ciferrii was cloned using nucleotide sequence homology. To use as a dominant selection marker that confers resistance to the antibiotic cycloheximide, the $56^th$ proline residue of the P. ciferrii L41 gene was changed to glutamine by site directed mutagenesis. The ribosomal DNA (rDNA) repeating unit of P. ciferrii was also cloned to use as target for multicopy gene integration into the chromosome and a locus, which could induce high frequency integration of transforming DNA into the chromosome, was selected. A maximum frequency of integrative transformation of approximately 1,350 transformants/μg DNA was observed.
To improve the de novo synthesis of sphingolipid, the LCB2 gene encoding a subunit of serine palmitoyltransferase (SPT), which catalyzes the first committed step of sphingolipid synthesis, was cloned from P. ciferrii. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene was cloned from P. ciferrii and its promoter was used for overexpression of LCB2 gene. All transformants transformed with an LCB2 gene expression cassette were observed to produce approximately two times more TAPS than the wild type.
In yeast, sphinganine (dihydrosphingosine) is hydroxylated at C-4 by sphinganine hydroxylase (SUR2) to produce phytosphingosine or converted to sphinganine-1-phosphate by sphingoid base kinases (LCB4 and LCB5). The accumulation of sphinganine in Saccharomyces cerevisiae strains defective in conversion of sphinganine, has been identified. Therefore, to produce high level of sphinganine in P. ciferrii, the conversion of sphinganine to phytosphinganine should be blocked. To disrupt P. ciferrii SUR2 gene, we constructed a targeted gene disruption system, using orotidine-5`-phosphate decarboxylase (URA3) selection marker for complementation of uracil auxotrophs. We cloned two alleles of URA3 gene from P. ciferrii and uracil auxotrophs were also constructed using the mutagenized P. ciferrii L41 gene and chemical mutagenesis. This system was applied for targeted disruption of SUR2 gene.
Sphingosine is produced by hydrolysis of ceramide in animal and rarely present in yeast. Sphingosine has chemical structure identical to phytosphingosine except a 4-trans double bond in sphingosine in place of hydroxyl group in phytosphingosine. Since sphingaine hydroxylase belongs to diiron motif-containing hydroxylase/desaturae family, to produce sphingosine in yeast, the possibility of production of sphingosine from sphinganine by directed evolution of sphinganine hydroxylase to sphinganine desaturase (sphingosine synthase) was explored in S. cerevisiae. Effective and strong screening/selection of desired variants is prerequisite for directed evolution of biocatalysts. A novel screening system was constructed using human sphingosine kinase to discriminate sphingosine from sphinganine and phytosphingosine. This system was applied for evolution of sphinganine hydroxylase to sphinganine desaturase in S. cerevisiae successfully.
Pichia ciferrii는 아세틸기가 첨가된 과량의 sphingoid base를 세포 밖으로 분비시키는 특성이 있는 효모이다. 대부분의 분비된 sphingoid base 는 sphingolipids의 전구체인 tetraacetyl phytosphingosine (TAPS)이다. 대사공학적 방법에 의하여 TAPS 를 포함한 유용한 sphingoid base의 생산성을 향상시키기 위하여 P. ciferrii의 형질전환 방법을 개발하였다. 먼저 리보좀 단백질인 L41 단백질을 코딩하는 유전자를 P. ciferrii로부터 클로닝한 후 항생제 cycloheximide에 대한 저항성을 부여하기 위하여 site directed mutagenesis방법을 이용하여 56번째 proline을 gluramine으로 치환하였다. 또한 염색체 내로 다중도입을 유도하기 위하여 ribosomal RNA 유전자를 클로닝 하였으며 고효율의 integration을 유도하는 부위를 선별하였다. 구축된 형질전환벡터를 이용하여electro-transformation조건을 최적화 함으로써 벡터 DNA 1mg 당 대략 1,350개의 형질전환체를 얻을 수 있었다
P. ciferrii의 sphingolipid 생합성을 증가시키기 위하여 전체 반응의 율속 단계인 serine palmitoyltransferase를 코딩하는 LCB2 유전자를 P. ciferrii로부터 클로닝하였다. LCB2 유전자의 발현을 향상시키기 위하여 효모에서 강력하게 발현되는 것으로 알려진 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 P. ciferrii로부터 클로닝 하였으며 GAPDH promoter를 이용하여 LCB2 유전자의 발현을 증폭시켰다. LCB2 발현 벡터로 형질전환된 모든 균주에서 TAPS 생산성이 모균주보다 2배정도 증가하는 것이 관찰되었다.
효모에서 sphinganine은 phytosphingosine을 생성하기 위하여sphinganine hydroxylase에 의하여 hydroxylation 되거나sphingoid base kinase에 의하여 인산기가 첨가된 sphinganine-1-phosphate로 전환된다. S. cerevisiae에서 이러한 sphinganine의 전환에 관여하는 유전자를 불활성화 시켰을 경우 세포내에 sphinganine이 축적됨을 확인하였다. 따라서 P. ciferrii에서 sphinganine을 생산하기 위해서는 sphinganine hydroxylase를 코딩하는 SUR2 유전자를 불활성화 시켜야 한다. 먼저 SUR2 유전자를 P. ciferrii로부터 클로닝 하였으며 세포내에 두 카피 존재하는SUR2 유전자를 순차적으로 불활성화 시키기 위하여 반복적 사용이 가능하도록 URA3 pop-out cassette와 uracil 영양요구성 균주로 구성된targeted gene disruption system을 구축하였다. Uracil 영양요구성 균주는 cycloheximide 내성 유전자와 화학적 무작위 돌연변이 방법을 이용하여 확보하였으며 이system을 SUR2 유전자의 disruption에 이용하였다.
동물세포에서 ceramide의 분해에 의하여 생성되는 sphingosine은 효모에는 거의 존재하지 않는 sphingoid base이다. Sphingosine은 4번째 탄소에hydroxyl기 대신 이중결합이 있는 것을 제외하면 phytosphingosine과 동일한 구조이다. Sphinganine hydroxylase는 diiron motif를 포함하는 hydroxylase/desaturase family이므로 효모에서 sphingosine을 생산하기 위하여 sphinganine hydroxylase를 directed evolution 기법을 이용하여 sphinganine desaturase로 전환하고자 하였다. Directed evolution 기법을 효소특성 개량에 적용하기 위해서는 효과적이면서도 손쉬운 선별방법의 개발이 필수적이다. 따라서 인간 유래의 sphingosine kinase 를 이용하여 sphingosine을 다른 sphingoid base와 구분하는 신규 선별방법을 확립하였으며 이러한 방법을 sphinganine hydroxylase 효소특성 개량에 이용하여 sphingosine생산성이 5-10배 증가한 균주를 선별할 수 있었다.
