Replicative senescence is a terminal differentiation state in which metabolically active cells are permanently and irreversibly growth-arrested, with enlarged and flattened morphology and expression of the senescence-associated β-galactosidase activity at pH 6.0 in normal mammalian cells. It has been shown that expression of several tumor suppressor genes such as p53, Rb, p21 and p16 can trigger replicative senescence program, which is inactivated in human tumor cells. However, a detailed mechanism by which tumor suppressor genes trigger replicative senescence is largely unknown.
The present study investigated a mechanism by p53 family proteins including two p53 homologues, p63 and p73 mediates senescence in tumor cells. p63 and p73, like p53, induced replicative senescence when overexpressed in a tetracycline-regulated manner in EJ cells lacking a functional p53. In addition to transcription activation of p53-responsive genes, p63 and p73 repressed transcription of the cdk1 and cyclin B genes, both of which were irreversibly repressed in senescent human fibroblast. Furthermore, DNA binding activity of NF-Y transcription factor, which is essential for transcription of the cdk1 and cyclin B genes and inactivated in senescent fibroblast, was significantly decreased by expression of either of p53, p63, or p73. Through these results, it is implicated that p53 family induce replicative senescence through inhibition of NF-Y activity.
Based on above results, it was further examined whether anti-apoptotic Bcl-2 family proteins affects to p53-induced replicative senescence. Anti-apoptotic function of Bcl-2 family has been thought to contribute its oncogenic potential. Although the detailed mechanisms of its anti-apoptosis function remain unknown, Bcl-2 family has been shown to affect a variety of biochemical changes during apoptosis. To address whether Bcl-2 family proteins affect to senescence in tumor cells, human bladder cancer cells, EJ, expressing Bcl-2, $Bcl-x_L$, or E1B-19K were established. EJ cells expressing each Bcl-2 family protein were infected with a recombinant adenovirus encoding p53 and examined for senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) activity. Cells with Bcl-2 family proteins showed significantly decreased level of SA-β-Gal activity compared to EJ cells. Moreover, Bcl-2 family blocked doxorubicine-induced senescence in EJ cells, regardless of the presence of p53 protein. Bcl-2 family proteins did not affect to growth arrest, but blocked entry into replicative senescence after p53 expression.
Recent evidences suggest that mitochondrial dysfunction such as membrane potential (Δψ) loss and ROS generation is prevented by Bcl-2 family proteins and aging is associated with mitochondrial dysfunction. After expression of p53, mitochondrial membrane potential was decreased in EJ cells, but not cells expressing $Bcl-x_L$ or E1B19K. Cyclosporin A(CsA), inhibitor of membrane potential (Δψm) loss, also inhibited p53-induced senescence in EJ cells, suggesting Δψm is involved with p53-induced senescence. Since it has been reported that reactive oxygen species (ROS) play a key role in replicative senescence, ROS generation during p53-induced senescence was investigated. After p53 expression, ROS level were significantly increased. However, ROS levels in EJ cells expressing Bcl-2 family were not significantly changed, as compared with that of p53-expressing EJ cells. When antioxidants such as NAC (N-acetyl-L-cysteine) and PDTC (1-Pyrrolydine dithiocarbamate) were employed, the anti-oxidants also blocked p53-induced senescence in parallel with inhibition of an increase in ROS level. Moreover pro-oxidants, such as tert-butylhydroperoxide (t-BHP), lead to senescence in cells expressing Bcl-2 family proteins. These results suggest that Bcl-2 family proteins block senescence through prevention of the decrease in mitochondrial membrane potential and regulation of ROS generation.
세포노화는 정상 포유동물세포에서 대사활동중인 세포가 크고 편평한 형태와 함께, pH 6.0.에서 노화 관련 b-galactosidase 활성을 발현하면서, 영구적이고 비가역적으로 성장을 정지하는 최종 분화 단계를 의미한다. p53, Rb, p21, p16 등과 같은 몇몇 종류의 종양억제인자들은 원래 불활성화되어있는 인간 종양세포들에서 세포노화 프로그램을 유도하는 것으로 알려져 있지만, 어떤 작용기작을 통하여 세포노화를 유도하는지는 잘 알려져 있지 않은 편이다.
본 연구에서는 p63, p73 등과 같은 p53 단백질군이 종양세포에서 세포노화를 매개하는 작용기작을 조사하였다. p63과 p73은 p53이 기능하지 못하는 EJ 세포에서 tetracycline 조절 방식으로 과발현되었을 때, 세포노화를 유도하였다. 또한, p63과 ,p73은 노화된 인간 섬유아세포에서 비가역적으로 억제되어 있는 cdk1과 cyclin B 유전자의 전사를 억제하였다. 더우기 cdk1과 cyclin B의 전사에 필수적이고 노화된 섬유아세포에서 불활성화되어 있는 NF-Y 전사인자의 DNA 결합 활성이 p53 단백질군의 발현에 의해 현저하게 감소되는 것으로 나타났다.
이상의 결과를 바탕으로 anti-apoptotic Bcl-2 단백질군이 p53에 의한 세포노화에 영향을 주는지를 조사하였다. Bcl-2 단백질군 중에서 Bcl-2, $Bcl-x_L$ 또는 E1B19K는 항세포사멸기능으로 인해 oncogenic potential 을 지니며, apoptosis가 일어나는 동안 다양한 생화학적 변화에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. Bcl-2 단백질군이 종양세포의 노화에 미치는 영향을 알아보기 위하여, Bcl-2, $Bcl-x_L$ 또는 E1B19K를 발현하는 EJ 세포주를 수립하였으며, 재조합 아데노바이러스를 이용하여 p53의 발현을 유도한 후, 노화관련 β-galactosidase (SA-β-gal) 활성을 조사하였다. Bcl-2 단백질군을 과발현하는 세포들은 EJ 세포에 비하여 현저하게 낮은 SA-β-gal 활성을 보였으며, 또한, p53 단백질의 존재여부와 관계없이, EJ 세포에서 doxorubicine에 의해 유도되는 세포노화도 저해하였다. Bcl-2 단백질군은 세포성장 정지에 영향을 주지는 않았으며, p53 발현후에 세포노화 단계로의 진입을 저해하는 것으로 나타났다.
최근의 연구들을 보면 막전위 (membrane potential, Δψm) 손실과 활성산소인자(ROS) 생성과 같은 미토콘드리아 기능상실이 노화와 연관되어 있을 뿐 아니라, Bcl-2 단백질군에 의해 억제된다고 보고되어 있다. EJ 세포에서 p53의 발현 이후, 미토콘드리아 막전위 Δψm) 가 감소하였으며, Bcl-2 단백질군을 발현하는 세포에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았다. 또한, 막전위 감소를 억제하는 CsA(cyclosporin A)를 처리했을 경우에도 p53에 의한 세포노화가 저해를 받았으므로, p53에 의한 세포노화에 미토콘드리아 막전위의 감소가 관여함을 알수 있었다. p53에 의한 세포노화과정에서 ROS 생성을 조사한 결과, p53의 발현 이후에, EJ 세포주에서의 ROS 레벨은 현저하게 증가하였지만, Bcl-2 단백질군을 발현하는 EJ 세포에서는 큰 변화가 없었다. NAC, PDTC 와 같은 항산화제를 처리하였을 때, 항 산화제들은 ROS 증가를 억제함과 동시에 p53에 의한 세포노화 또한 저해하였다. 또한, 산화제로서 $H_2O_2$ 를 이용하였을 때, Bcl-2 단백질군을 발현하는 세포에서 노화세포의 비율이 증가하였다. 이러한 결과들은 Bcl-2 단백질군이 미토콘드리아 막전위 감소를 억제하고 ROS 생성을 조절함으로써 p53에 의한 세포노화를 억제함을 말해주고 있다.
