The D-hydantoinase from Bacillus stearothermophilus SD1 is a versatile industrial enzyme for commercial production of D-amino acids, but has relatively low activity for aromatic hydantoin derivatives used as raw materials for important pharmaceuticals, such as semi-synthetic antibiotics. Hydantoinase has been proposed to be a member of cyclic amidohydrolases, including dihydropyrimidinase, allantoinase, and dihydroorotase. Based on the rigidly conserved region of the related enzymes, a putative cyclic amidohydrolase gene from Escherichia coli was identified and characterized as phenylhydantoinase from its distinct substrate specificity for aromatic hydantoin derivatives. To elucidate the substrate specificity determinants and improve the catalytic properties of D-hydantoinase, we determined the three dimensional structure of D-hydantoinase and compared it with that of dihydroorotase. Major difference between their active sites is shown in the conformations of three loops, which are designated stereochemistry gate loops or SGLs. In addition, simulation of substrate binding in the active site of D-hydantoinase revealed that the hydrophobic and bulky residues of SGLs constitute a hydrophobic substrate binding pocket around the exocyclic substituent of substrate. Substitution of these residues, specifically Leu 65, Tyr 155, and Phe 159 near exocyclic group of substrate, to a charged amino aicd, Glu resulted in a significant decrease in the activity for hydantoin, but not for aromatic substrate such as D,L-5-hydroxyphenyl hydantoin (HPH). Based on the structures and these results, we compared the active sites of various D-hydantoinases with distinct substrate specificity, and designed new D-hydantoinase with desirable property. Met 63, Leu 65, Phe 152, and Phe 159 of SGLs were site-directed mutated to improve activity for aromatic substrates. The designed mutant enzymes show a remarkable change in substrate specificity. Particularly, the mutation F159A significantly improves activity for bulky hydantoin derivatives and reduces activity for small substrate. Saturation mutagenesis at position 159 revealed that Kcat and affinity for bulky substrates increase gradually as size of the side chains decrease, probably, removing steric hindrance between bulky exocyclic substituent of substrate and large side chain. Double mutation M63F/L65V, which is thought to enlarge the active site, also increases activity for aromatic hydantoin derivatives. When site-directed random mutagenesis of position 63 and 65 was introduced at mutant F159A, additional single mutation L65F further increase Kcat value for aromatic substrate, but conversely, mutation L65W in cooperation with substitutions to small amino acids at position 63 significantly improve the reduced activity of mutant F159A for hydantoin, restoring the substrate specificity to that of wild type. These results suggest that the hydrophobic nature and conformation of stereochemistry gate loops are major determinants of substrate specificities of D-hydantoinases, and the manipulation of them may easily change the catalytic properties.
바실러스 스테아로써모필러스 SD1 (Bacillus stearothermophilus SD1) 의 D-히단토이네이즈 (D-hydantoinase) 는 D-아미노산의 상업적 생산에 이용되는 매우 유용한 산업용 효소이지만, 반합성 항생제와 같은 의약품의 전구체인 아로마틱 히단토인 유도체에 낮은 활성을 갖고 있다. 히단토이네이즈는 다이하이드로피리미디네이즈 (dihydropyrimidinase) 와 알란토이네이즈 (allantoinase), 다이하이드로오로테이즈 (dihydroorotase) 를 포함하는 사이클릭 아미도하이드롤레이즈 (cyclic amidohydrolase) 의 하나로 알려지고 있다. 이 효소들 사이에서 진화상 본존 되어 있는 부분들에 근거하여 대장균 (Escherichia coli) 에서 사이클릭 아미도하이드롤레이즈로 추정되는 유전자를 발견하였는데, 이는 아로마틱 히단토인 유도체에 독특한 기질특이성을 갖는 페닐히단토이네이즈 (phenylhydantoinase) 로 밝혀졌다. 이런 D-히단토이네이즈의 다양한 기질특이성의 결정인자를 밝히고 촉매적 특성을 개량하기 위해 D-히단토이네이즈의 구조를 조사하여 이미 알려져 있는 다이하이드로오로테이즈의 3차 구조와 비교하였다. 이들의 활성부위 (active site) 에서 가장 큰 차이는 광학적이성질체 결정 고리 (stereochemistry gate loops or SGLs) 로 명명되는 세 개의 고리 (loop) 의 모양에서 찾을 수 있었다. 뿐만 아니라, D-히단토이네이즈의 활성부위에서 기질 결합의 모의 실험 결과, SGLs에서 소수성의 큰 곁사슬 (side chain)을 가진 아미노산들이 기질의 치환기 근처에 소수성의 기질 결합 부위를 형성하고 있었다. SGLs의 소수성 아미노산들 중 특히 기질의 치환기 근처에 위치한 Leu 65 와 Tyr 155, Phe 159를 극성을 가진 아미노산인 Glu로 치환시키면, D,L-5-하이드록시페닐 히단토인 (D,L-5-hydroxyphenyl hydantoin or HPH) 과 같은 아로마틱 기질에 비해 히단토인 (hydantoin) 에 대한 활성이 크게 감소하였다. 우리는 이런 실험 결과와 3 차 구조를 바탕으로 독특한 기질 특이성을 갖고 있는 여러 히단토이네이즈의 활성 부위를 비교하여 원하는 특성을 가지는 새로운 D-히단토이네이즈를 설계하였다. 바실러스 스테아로써모필러스 SD1에서 얻어진 D-히단토이네이즈의 아로마틱 기질에 대한 활성을 향상시키기 위해, 먼저 SGLs에서 Met 63 과 Leu 65, Phe 152, Phe 159를 위치 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) 를 일으켰다. 생성된 변이 효소들은 기질 특이성에서 매우 큰 변화를 보였다. 특히, 변이효소 F159A는 큰 치환기를 가진 히단토인 유도체에 대한 활성이 크게 증가한 반면 작은 기질에 대한 활성은 상당히 감소하였다. Phe 159 위치에서 모든 다른 아미노산으로 치환하였을 때, 작은 곁사슬로 바뀐 변이효소일수록 큰 치환기를 가진 기질에 대한 높은 Kcat과 친화성 (affinity) 을 보였다. 이는 기질의 큰 치환기와 아미노산의 큰 곁사슬 사이의 공간적 방해 (steric hindrance) 가 변이에 의해 감소되기 때문으로 생각된다. 또한, 활성 부위를 크게 만들 것으로 보이는 이중 변이 M63F/L65V도 아로마틱 히단토인 유도체에 대한 활성을 증가시켰다. 변이효소 F159A의 63과 65번 위치에서 무작위로 위치특이적 변이를 일으켰을 때, 하나의 추가 변이 L65F 만으로 아로마틱 기질의 Kcat을 더욱 증가시킬 수 있었고, 반대로 변이 L65W는 63에서 작은 곁사슬의 아미노산으로 바뀐 변이와 함께 작용하여 히단토인에 대하여 감소한 활성을 야생종의 기질 특이성과 비슷할 정도로 크게 향상시켰다. 이런 실험 결과들은 SGLs의 소수성적인 특성과 형태가 D-히단토이네이즈의 기질 특이성을 결정하는 매우 중요한 인자임을 시사하고 있으며, 이를 조작하여 촉매적 특성을 쉽게 변형시키는 것이 가능할 것이다.
