A Mediator complex is the major, multi-protein transcriptional coactivator complex in Saccaharomyces cerevisiae and Higher eukaryotes. A Mediator of Higher Eukaryotes like Drosophila and human is consisted of a subset of proteins conserved within metazoans and the other subset of proteins that are conserved throughout development. To decipher the mechanistic roles of Mediator proteins in regulating developmental specific gene expression, we isolated and analyzed a multiprotein complex containing Drosophila Mediator (dMediator) homologs. dMediator complex interacted with diverse sets of transcriptional activator proteins to elicit sophisticated regulation of gene expression and was critical for activated transcription in response to diverse transcriptional activators. The distinct phenotypes associated with certain mutations in some of the Mediator genes and the specific in vitro interactions of Mediator gene products with transcriptional activator proteins suggest the presence of activator-specific binding subunits within the Mediator complex. However, the physiological relevance of these selective in vitro interactions has not been addressed. Therefore, we analyzed dTRAP80, one of the putative activator binding subunit of Mediator, for specificity of binding to a number of natural transcriptional activators from Drosophila. Among the group of tested activator proteins (Armadillo, Dif, Hsf, Notch, RxR, VP16) that requires Mediator complex for transcriptional activation, only a subset (Dif, Hsf, Notch, RxR, VP16) of these proteins interacted with dTRAP80 in vitro, and only these dTRAP80-interacting activators were defective for activation under dTRAP80-deficient in vivo conditions. In particular, activation of Drosophila antimicrobial peptide (AMP) drosomycin gene expression by NF-κB-like transcription factor Dif during induction of the Toll signaling pathway was dependent on dTRAP80 module. These results, and the indirect support from the dTRAP80 artificial recruitment assay, indicate that dTRAP80 serves as a genuine activator-binding target responsible for a distinct group of activators. To find Mediator components which were required for the activation by dTRAP80-independent activators, and examine if other essential components except dTRAP80 were required for activation by activators interacting with dTRAP80, we examined the effect of each Mediator deficiency induced by RNA interference on transcriptional activation by these activators in SL2 cells containing transcriptional template stably. 12 components of tested 25 components affected specifically transcriptional activations by the activators in their depletion in vivo. Most of dTRAP components were essential for transcriptional activation by the activators interacting with dTRAP80. In addition to these, some of dMed components, dSUR2, dARC92, and dP34 were required for activation by these activators . Intriguingly, Armadillo required dCycC for activation. However, the required components for activation by Notch could not be found in this screening. Among the dTRAP80-interacting activators, there were the groups of activators requiring the common Mediator components for their functions. Also, the different Mediator components were required according to these activator groups.
전사 매개 복합체 (Mediator complex) 는 효모와 고등 진핵 세포 내에 존재하는, 여러 단백질 인자들로 구성된 복합체이며, 유전자 전사 (transcription) 에서 중요한 보조 활성화 인자 (coactivator) 이다. 초파리나 사람과 같은 고등 진핵 세포의 전사 매개체는 후생 동물들 (metazoans) 내에 보존되어 있는 단백질들의 구성체와 진화 과정에서 보존되어 있는 그 외의 단백질들의 구성체로 이루어져 있다. 진화 과정에서의 특이적인 유전자들의 발현을 조절하는데 있어서 전사 매개체 인자들의 역할을 알아보기 위해, 초파리에서의, 사람과 효모의 전사 매개체 인자들의 유사체 (homolog) 를 포함하고 있는 다중단백질 복합체를 분리하고 이것을 분석하였다. 초파리 전사 매개 복합체는 정교한 유전자 발현의 조절을 이끌어 내기 위해 다양한 유전자 활성화 인자 (transcriptional activator) 와 생체 조건 밖 (in vitro) 에서 직접 결합을 하고 있었으며, 또한 이들 활성화 인자들에의 의해 야기되는 활성화된 유전자 전사 (activated transcription) 에 결정적으로 필요하였다. 전자 매개체 인자들을 발현하는 유전자들 중 일부의 변이에 의해 야기되는 독특한 형질 (phenotype) 들과 전사 매개체 인자들과 유전자 활성화 인자들 간의 특이적인 결합은 전사 매개 복합체내에 유전자 활성화 인자들과 직접 결합하는 구성 성분들이 존재함을 말해준다. 그러나, 이런 선택적인 결합들과 그것의 생리적인 연관성을 알아보려는 시도는 아직 이루어지지 않았다. 그러므로, 이에 대한 접근을 위해 우리는 초파리의 TRAP80 유사체를 분석하였다. 초파리 TRAP80은 전사 매개 복합체 내에서 초파리의 여러 유전자 활성화 인자와 특이적으로 결합하는 것으로 추정되는 전사 매개체 인자들 중 하나이다. 이번 실험에서 관찰된 유전자 활성화 인자들 (Armadillo, Dif, Hsf, Notch, RxR, VP16) 은 그들에 의한 유전자 전사의 활성화를 위해 직접적인 결합을 통해 전사 매개 복합체를 필요로 하고 있었으며, 이들 중 일부 (Dif, Hsf, Notch, RxR, VP16) 는 생체 조건 밖에서 초파리 TRAP80과 결합을 하였다. 그리고, 초파리 TRAP80과 결합하는 유전자 활성화 인자들은 세포내 (in vivo) 에서 초파리 TRAP80이 결핍 되었을때 유전자 활성화를 시키지 못하였다. 특히, Toll 신호 전달 과정 (Toll signaling pathway) 중에 사람 유전자 활성화 인자인 NF-κB의 초파리 유사체인 Dif에 의한 초파리 항균 펩타이드 (antimicrobial peptide) 인 드로소마이신 (drosomycin) 유전자 활성화에서 초파리 TRAP80을 필요로 하였다. 이런 결과들, 그리고 초파리 TRAP80의 인위적인 유전자 프로모터 (promoter) 로의 결합 실험(artificial recruitment assay)에서의 간접적인 결과로 비추어 볼 때, 초파리 TRAP80은 일부 유전자 활성화 인자들에 의한 유전자 활성화에서 이들 인자들의 진정한 결합 표적으로 작용 한다는 것을 알 수 있다. 초파리 TRAP80에 의존하지 않는 유전자 활성화 인자들에 의한 유전자 활성화에 필요한 전사 매개체 인자들을 찾고, 초파리 TRAP80에 의존하는 유전자 활성화 인자들에 의한 활성화에서 초파리 TRAP80 이외에 다른 전사 매개체 인자들도 필요한지를 알아보기 위해, 우선, 활성화되는 유전자를 인위적으로 SL2 세포에 넣어 안정화 시키고, RNA 간섭 기술 (RNA interference technique)에 의해 각각의 전사 매개체 인자들이 결핍되었을 때, 이것이 SL2 세포내에서 이들 유전자 활성화 인자에 의한 유전자 활성화에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 테스트된 스물다섯 개의 전사매개체 인자들 중 12개가, 세포내에서 그것들의 결핍 시에 선택적으로 유전자 활성화 인자들에 의한 유전자 활성화에 영향을 주었다. 초파리 TRAP80에 영향을 받는 유전자 활성화 인자들은, 전사 매개체 인자들 중 TRAP 복합체 내에 대부분의 전사 매개체 인자들에 영향을 받았고, 이것들 외에 MED 복합체 내에 일부 인자들과, 초파리 SUR2, 초파리 ARC92, 초파리 P34에 영향을 받았다. 특이하게, 초파리 TRAP80에 영향을 받지 않는 유전자 활성화 인자들 중에 Armadillo는 그것에 의한 유전자 활성화를 위해 전사 매개체 인자들 중 하나인 초파리 CycC를 필요로 하였다. Notch에 의한 유전자 활성화에 필요한 전사 매개체 인자는 이번 탐색에서 발견되지 않았다. 그러나, Notch 역시 전사 매개체 복합체와 생체 밖 조건에서 서로 결합을 하였으므로, 이번 탐색에서 빠진 다른 전사 매개체 인자를 필요로 할 것으로 생각된다. 초파리 TRAP80과 결합하는 유전자 활성화 인자들 중 그들의 작용을 위해 같은 전사 매개체 인자들을 필요로 하는 유전자 활성화 그룹들이 존재하였고, 이들 그룹마다 서로 다른 전사 매개체 인자들을 필요로 하였다.
