Activation of telomerase is pivotal step for cells to gain immortality. In human cells, telomerase activity is tightly regulated by the expression of its catalytic subunit, human telomerase reverse transcriptase (hTERT). In most human normal somatic cells, the hTERT gene expression is completely repressed at transcription level and this repression acts as an important gatekeeping mechanism against tumorigenesis. Here I demonstrate that the hTERT gene is a target of oncoprotein c-Jun and β-catenin/Tcf-4.First, I show that the hTERT gene is the target of c-Jun. Transient over-expression of c-Jun in human normal lung fibroblast cells (IMR90 and WI38) activated the hTERT promoter. Interestingly, TSA treatment completely abrogated this activation, indicating possible functional competition between c-Jun and HDAC. Furthermore, mutant c-Jun, which is specifically defective in DNA binding, did activate the hTERT gene expression, suggesting the possibility that c-Jun is associated with the hTERT promoter via other factors occupying the hTERT promoter. To further elucidate the detailed molecular mechanism of this activation, C-terminal serial deletion analysis of c-Jun was performed in human normal fibroblast, IMR90. Through this trial, leucine zipper domain is identified as critical region for this activation. Using GAL4 system, it was shown that c-Jun can act as a superactivator of Sp1 in human normal somatic cell, IMR90. In this system, mutant c-Jun, which could not activate the hTERT promoter, did not act as a superactivator of Sp1. Notably, plasmid immunoprecipitation (Plamid ChIP) showed that c-Jun was associated with the hTERT promoter via Sp binding sites. Taken together, these results show that c-Jun can act as a molecular switch turning Sp1 from repressor to activator in the course of tumorigenesis.Second, I demonstrate that the hTERT gene is the target of β-catenin/Tcf-4. Through expression cloning approach with cDNA library prepared from human normal kidney cells, β-catenin was identified as an activator of the hTERT gene expression. Activation by β-catenin required Tcf-4 among TCF/LEF family members. Furthermore, mutation in putative Tcf-4 binding site within the hTERT promoter abrogated the activating effects of β-catenin/Tcf-4, excluding the possibility that β-Catenin/Tcf-4 activated the hTERT gene expression through induction of c-Myc. Notably, stable expression of constitutively active form of β-catenin in HeLa cells increased both the endogenous hTERT gene mRNA level and telomerase activity. Meaningfully, introduction of wild type APC into SW480, colorectal cancer cell line with mutation in APC, significantly reduced the hTERT gene expression. Surprisingly, in vivo occupancy of the hTERT promoter by β-catenin was observed only in CRT positive cell lines, SW480 and HCT-116 but not in CRT negative cell line, HeLa. Taken together, these results suggest that constitutively active β-catenin/Tcf-4 activate the hTERT gene expression in colorectal cancer cells and wild type APC antagonize this activation in normal colorectal tissues.
암화 과정에서 세포는 반드시 immortality를 획득하여야 하는데 이 과정에서 telomerase는 매우 중요한 역할을 한다. 인간 세포에서 telomerase의 활성은 catalytic subunit인 human telomerase reverse transcriptase (hTERT) 유전자의 발현에 의해 조절된다. 대부분의 인간 정상세포에서는 hTERT 가 전혀 발현되지 않는 반면 약 80 % 정도의 암세포에서는 높은 수준으로 발현되고 있다.본 연구에서는 expression cloning 방법을 통해 발암유전자인 c-Jun과 β-Catenin의 과도한 활성이 hTERT 유전자 발현을 유발할 수 있음을 알아내었으며 그 분자 메카니즘을 밝혔다.첫째 배양 상태의 인간 정상세포에서 발암유전자 c-Jun을 과발현 시켰을 때 telomerase activity가 유발되는 것을 확인할 수 있었다. hTERT 유전자 promoter의 serial deletion analysis와 plasmid immunoprecipitation assay (Plasmid IP)를 통해 c-Jun이 Sp binding sites를 통해 hTERT promoter에 결합하는 것을 확인하였다. 또한 histone deacetylase (HDAC)의 활성을 억제하는 화합물인 TSA의 처리에 의해 c-Jun에 의한 hTERT 유전자의 발현이 억제되는 사실과 GAL4 system에서 c-Jun이 Sp1의 superactivator로 작용할 수 있다는 사실을 확인함으로서 c-Jun이 hTERT promoter상에 결합하고 있는 Sp1 단백질에 대해 HDAC과 경쟁적으로 결합함으로서 hTERT 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 이 결과는 hTERT 유전자가 암세포 특이적으로 발현되는 현상을 설명할 수 있는 분자 메커니즘의 전형을 제공하고 있다고 생각한다.둘째 배양 상태의 암세포에서 발암유전자인 β-Catenin의 과발현이 telomerase activity를 유도할 수 있음을 확인하였다. 4개의 TCF/LEF family member중 Tcf-4가 β-Catenin과 복합체를 형성하여 hTERT 유전자의 발현을 유도하며 이것은 c-Myc의 발현유도에 의한 간접적 효과가 아닌 것을 확인하였다. 또한 hTERT promoter의 serial deletion을 통해 β-Catenin/Tcf-4 responsive element를 찾아내었다. 대장암 세포인 SW480 세포에 정상 Adenomatous Polyposis Coli (APC)를 도입하였을 때 hTERT 유전자의 발현이 현격히 감소되는 것을 확인함으로써 β-Catenin/Tcf-4가 SW480 세포 내에서 실제로 hTERT 유전자의 발현에 중요한 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다. 더 나아가 β-Catenin이 β-Catenin/Tcf responsive transcriptrion (CRT) 양성인 SW480, HCT-116 세포에서만 hTERT promoter에 binding하고 있음을 chromatin immunoprecipitation assay를 통해 확인하였다. 이러한 결과들은 β-Catenin/Tcf-4가 CRT 양성 세포 특이적으로 hTERT 유전자의 발현을 유도하고 있음을 보여주고 있다.
