Telomerase is important in cellular proliferative activity. Human telomerase reverse transcription (hTERT) is the catalytic subunit and key component of telomerase. The transcription of hTERT is limit-rate step of telomerase. Telomerase activity decreases in response to TGF-β. Through transient reporter assay, we find that hTERT promoter activity decreases, too. To identify the major regulatory element which contributes this decline of promoter activity, serial deletion analysis was done. As the result, we find that TGF-β represses hTERT promoter via E2F-site. The result of reporter assay with single mutant constructs on hTERT promoter agrees with this fact. Many promoter repressed in G0/G1 arrest are regulated by E2F-pocket protein complex via E2F-site. Through Chromatin IP assay, we confirmed that E2F4 and p130 bind to hTERT promoter in TGF-β treated HaCaT cells. Therefore, we suppose that E2F4-p130 complex through E2F-binding site regulate the hTERT promoter activity in response to TGF-β.
세포가 암세포로 변화는 과정은 크게 두 개의 과정을 거쳐야 한다. 첫 번째는 cell cycle이 조절되지 않고, 무한분열을 하게 되는 과정으로 cell cycle을 조절하는 p53, pRb같은 단백질의 돌연변이화되면서 이루어진다. 이렇게 무한 분열하게 된 세포는 결국 수명을 다해 분열을 멈추고 죽게 되는데, 간혹 이 한계를 넘어 죽지 않고 계속 분열을 하는 세포가 나타난다. 이 과정에서 중요한 역할을 하는 것이 Telomerase이다.
Telomerase는 일종의 역전사효소로 telomere의 길이를 유지하는 역할을 한다. 이 telomere의 길이가 짧아지면, chromosomal fusion등에 의한 유전자 상실로 인해 세포가 죽게 된다. 이러한 역할을 하는 Telomerase는 그 구성요소 중 하나인 hTERT의 발현에 의해 조절되며, 이 hTERT는 거의 대부분의 정상적인 인간세포에서 발현이 되지 않는다. 반면에 거의 암세포에서 발현되어 immortality에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
그 동안의 연구로 WT1, Sp1, E2Fs, MZF-2, c-Myc, Estrogen등에 의해 hTERT promoter의 활성이 조절된다는 사실이 밝혀졌으며, 본 연구에서는 TGF-β 에 hTERT promoter의 활성변화와 그 기작에 대해 알아보았다. 먼저 TGF-β에 대한 response element를 찾기 위해, Serial deletion analysis를 수행하였고, 그렇게 찾아낸 부분에 위치한 Transcription Factor binding site를 각각 돌연변이화시켜 확인하였다. 이상의 결과로 -73에서 -51정도에 위치하고 있는 E2F-site가 중요하다는 사실을 알아내었다. 또한, ChIP assay를 통해 E2F4와 p130이 TGF-β 에 의한 hTERT 유전자의 억제에 중요한 요소로서 관여한다는 사실을 직접적으로 밝혀내었다.
사실, E2F site에 의한 유전자 발현저해효과는 이미 보고된바 있으며, 대개는 E2F4 또는 E2F5가 pocket protein과 결합하여 이루는 복합체에 이루어진다. 이 복합체는 HDAC를 포함하여 HDAC에 의한 전사저해를 일으킨다고 보고되고 있으며, TGF-β 에 의해서도 E2F site를 통한 E2F-Pocket protein 복합체의 저해기작이 보고된바 있다. 이러한 기작으로 저해되는 유전자들에 cell cycle조절에 관여하는 유전자들이 포함된 사실은 TGF-β 에 의해 G0/G1 arrest가 일어난다는 사실로 미루어볼 때, hTERT promoter의 조절에 E2F/pocket protein 복합체가 관여하는 사실은 당연하다고 할 수 있다.
