Erythropoietin, Epo, is a hematopoietic factor promoting production and differentiation of erythroid precursor cells and the recombinant human Epo has been used for the treatment of anemia. Four fusion proteins were designed and constructed by adding peptides on the carboxy terminus of Epo with no linker in order to increase the half-life of Epo. Epo-CTP is a fusion protein of Epo and carboxy terminal peptide (CTP, 28 a.a) of human chorionic gonadotropin beta subunit. Epo-ATP is a deglycosylated mutant of the Epo-CTP by changing Ser to Ala on CTP. Epo-LTP is a fusion protein of Epo and C-terminal half region (178 a.a) of human thrombopoietin (hTpo). And Epo-STP consists of Epo and a short C-terminal peptide (17 a.a) of hTpo. CHO cells were transformed by the expression vectors, pcDNA3.1, of Epo derivatives. Secretion of the Epo derivatives from the cell was not influenced by the peptide addition on the Epo terminus. Also, in vitro bioassay showed that receptor binding of the Epo derivatives were not interfered with the added peptides. The expressed Epo derivatives were purified using immunoaffinity chromatography. Rats were administered with the Epo derivatives intravenously and subcutaneously, which it was shown that CTP and ATP similarly doubled terminal half-life of Epo in spite of their small size. So, it is apparent that the in vivo stabilizing effect of CTP on Epo was resulted from the peptide itself rather than its O-glycosylation. Epo-STP showed longer half-life than Epo but relatively shorter than other derivatives. This might be due to the lost of one N-glycosylation and the different glycosylation type. The sustained elimination of Epo-LTP can be resulted from the protection of LTP having bulky glycosylation in both i.v and s.c pharmacokinetic study. Epo-LTP was slowly absorbed than other derivatives and it can be result from the large size. In vivo activity of Epo derivatives in subcutaneously administered mice was confirmed and is consistent with the pharmacokinetic profiles. Therefore, the long half-life of Epo derivatives possibly reduces the frequency of administration.
에리스로포이에틴 (Erythropoietin, Epo)은 조혈모 세포의 성장과 분화를 촉진하는 혈액인자로서, 인간 재조합 에리스로포이에틴은 빈혈 치료에 광범위하게 사용되어져 왔다. 이러한 에리스로포이에틴은 체내 반감기가 짧다는 단점이 있고, 이의 단점을 극복하기 위한 여러 연구들이 진행되어져 왔다. 본 연구에서는 에리스로포이에틴의 카르복시 말단에 일련의 펩타이드를 링커를 사용하지 않고 접합 시킴으로써 Epo 변형체인 4가지의 융합 단백질을 구성하였다. Epo-CTP는 Epo와 인간 융모막 단백질 (hCG)의 베타 서브유닛의 카르복시 말단 펩타이드(CTP, 28 a.a)의 융합 단백질이다. Epo-ATP는 Epo-CTP의 당(O-glycosylation)이 제거된 변형체로서, CTP의 당화 위치인 Ser을 Ala로 치환함으로써 완성 되었다. Epo-LTP는 Epo와 인간 쓰롬보포이에틴 (Thrombopoietin, Tpo)의 카로복시 부분인 178개의 아미노산으로 구성된 펩타이드와의 융합 단백질이다. Epo-STP는 Epo와 Tpo의 카르복시 말단 17개의 아미노산으로 구성된 펩타이드와의 융합 단백질이다. 이들 Epo 변형체의 발현을 위하여 각 유전자를 동물세포 발현 벡터인 pcDNA3.1에 클로닝 하였고, 클로닝된 각 벡터는 중국 햄스터 난자(CHO) 세포의 형질전환에 이용되었다. Epo 말단에 추가된 펩타이드는 발현된 단백질의 세포 밖으로의 배출에 아무런 영향을 주지 않았다. 또한 시험관내 시험에서 확인하였을 때 추가된 펩타이드는 Epo와 그 수용체와의 결합 또한 방해하지 않았다. 발현된 Epo 변형체들은 면역친화 크로마토그라피 방법으로 정제하였다. 반감기 등의 약동력학 연구를 위해 정제된 각 Epo 변형체들을 쥐의 정맥 및 피하를 통하여 각각 주사하였다. CTP와 ATP는 그들의 크기가 작음에도 불구하고 비슷하게 Epo의 반감기를 두배 이상 증가 시켰다. 또한 Epo에 대한 CTP의 체내 안정화 효과는 CTP의 당(O-glycosylation)보다는 펩타이드 자체에 의한 것임은 명백하였다. Epo-STP 또한 Epo 보다 훨씬 긴 반감기를 보였지만 다른 변형체에 비해서는 상대적으로 그 효과가 적었다. 이것은 당 소화 분석에 의해 당이(N-glycosylation) 하나 이상 결손 되었고 또한 당의 유형이 다르기 때문으로 추정된다. Epo-LTP의 긴 반감기는 LTP의 큰 분자량 및 많은 당에 의한 것으로 생각된다. 주 일회 피하 투여된 생쥐에서의 역가시험에서 Epo는 활성이 미약하였으나 Epo 변형체들은 좋은 활성을 보였으며 이러한 활성의 정도는 약동력학에서의 결과와 일치하는 활성도를 보여주었다. 따라서 이 Epo 변형체들은 투여회수를 Epo의 주3회를 주1회로 줄일 수 있는 강력한 후보이다.
