XPF-ERCC1 is a heterodimeric protein complex involved in nucleotide excision repair(NER), DNA cross-link repair and recombination. XPF-ERCC1 acts as a structure-specific DNA endonuclease, cleaving at duplex-single-stranded DNA junctions. In repair, XPF-ERCC1 makes an incision on the 5’ side of the lesion. XPF or ERCC1 alone is unstable in mammalian cells in the absence of its partner. To understand the reason why XPF and ERCC1 are unstable without partners, the structural studies of the interaction domains are needed. We expressed the recombinant proteins (ERCC1 binding domain of XPF and XPF binding domain of ERCC1), in order to obtain large amount of XPF-ERCC1 complex for the structural analysis. The purified XPF sub-domain was present as a soluble trimer, which was confirmed by gel permeation chromatography (GPC). However, ERCC1 sub-domain was expressed as an inclusion body and it was solublized with 8M urea and purified using Sepharose column under denaturing condition. The refolding of XPF and ERCC1 together was achieved via the stepwise dialysis to remove the denaturant. We obtained milligram quantities of XPF-ERCC1 complex from the optimized refolding protocol . XPF-ERCC1 complex formation is established by a direct interaction between these two binding domains. Refolded XPF-ERCC1 complex is native state as shown by GPC, NMR and binding study. The complex formation as a soluble form is essential to structural studies of the interaction domains. NMR studies of these domains can be used to localize protein-protein binding site and to obtain detailed structures of these domains. These structural studies can provide critical information on interaction between XPF sub-domain and ERCC1 sub-domain. This may suggest why the proper complex formation is required for stability of the two proteins.
XPF-ERCC1은 NER, DNA cross-link 회복, 재조합에 관여하는 단백질 복합체이다. 또한 XPF-ERCC1은 duplex-single-stranded DNA 접합부위에서 구조에 특이적으로 작용하는 DNA endonuclease이다. 회복과정에서 XPF-ERCC1은 손상된 DNA 부위의 5'쪽을 자르는 역할을 한다. 색소성 건피증 group F 환자의 경우는 XPF 소단위체에 변이가 일어나 생기며, 이 환자들은 일반적으로 DNA 손상회복에 있어서 결핍을 갖는 임상적인 증상을 나타낸다. 진찰된 결과 모든 XP-F 환자들은 체내에서 XPF-ERCC1이 낮게 존재한다고 알려져 있다. 이는 XPF와 ERCC1의 안정성에 있어서 적절한 단백질 복합체의 형성이 필요함을 나타내는 것이다. XPF나 ERCC1이 복합체의 형태가 아니라 단독으로 포유동물 체내에서 존재할 때는 불안정하다. 이러한 이유를 이해하기 위해서 두 단백질의 상호 작용하는 domains에 대한 구조적인 연구가 필요하다. 구조분석을 위한 XPF-ERCC1 복합체의 많은 양을 얻기 위하여 재조합 단백질로써 XPF의 ERCC1 binding domain과 ERCC1의 XPF binding domain을 발현시켰다. 정제된 XPF sub-domain은 GPC로 확인한 결과 soluble trimer형태로 존재하였다. 그러나 ERCC1 sub-domain은 세포 안에 봉입된 형태로 발현되어서 8M urea로 녹인 후, 변성된 상태에서 Sepharose column을 사용하여 정제하였다. XPF와 ERCC1의 refolding은 denaturant를 제거하기 위해 단계적인 dialysis를 통하여 이루어졌다. 최적화된 refolding 방법을 통해 XPF-ERCC1 복합체를 밀리그램 양으로 얻을 수 있었다. Refolded XPF-ERCC1 복합체는 GPC, NMR 그리고 binding assay를 통한 결과에서 나타나는 것처럼 native 상태로 존재함을 알 수 있었다. 이러한 interacting domain에 대한 NMR 연구를 통해 protein-protein binding site의 위치를 확인하고 보다 상세한 구조정보를 얻을 수 있을 것이다. 따라서 NMR를 이용한 XPF-ERCC1 complex에 대한 구조연구는 두 단백질의 안정성에 있어서 적절한 complex형성이 어떻게 이루어지는가에 대한 정보를 제공할 수 있을 것이다.
