Covalent modification of proteins by the small, evolutionary conserved protein ubiquitin plays a central role in a variety of cellular processes, including bulk protein degradation, cell-cycle control, DNA repair, signal transduction, and transcriptional regulation. Cellular proteins to be degraded are covalently tagged with multiubiquitin chains that are recognized by the 26S proteasome. Although the 20S core performs the degradation, the 19S regulatory cap complex is responsible for the recognition of polyubiquitinated substrates. One subunit of the 19S component, S5a, has been shown to bind polyubiquitin chains as well as the ubiquitin-like domain of hHR23B, the human homologue of the yeast Rad23 protein. We have fosused on hHR23B-S5a complex using nulear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This study elucidates the specific interaction between the ubl domains of hHR23B and S5a.
Ubl domain of hHR23B (1-81) with a N-terminal six histidine tag overexpressed as a soluble form in E.coli. And PUBS2 domain of S5a with GST tag overexpressed as a soluble form in E.coli. Several domains of GST fusion proteins were constructed such as 263 to 307, 263 to 315, and 263 to 342, respectively. However, GST-S5a (253-342 ) forms dimmer that comfirmed by HPLC and corss-linking experiments. Also GST-S5a (263-307) is less overexpressed than GST-S5a (263-315) so that we prepared the GST-S5a (263-315) for further NMR study. Binding assay confirmed the interaction between hHR23B and GST-S5a (form 263 to 342). To characterize the interaction with S5a, a NMR study was performed where the $^{15}N-^1H$ HSQC spectrum of ubl domains of hHR23B was monitored upon addition of excess of S5a. Concentrations were calculated by using extinction coefficients based on amino acid composition. Reversely, to characterize the interaction with hHR23B, a NMR study was performed where the $^{15}N-^1H$ HSQC spectrum of S5a was monitored upon addition of excess of hHR23B. We confirmed the stable complex between this two domains through $^{15}N-HSQC$.
The backbone of ubl domain of hHR23B-S5a complex resonances $(C^α, C^β, CO, N^H, and H^N)$ were fully assigned using several hetero-nuclear NMR spectroscopy ; CBCA(CO)NH, HNCACB, $^1H-^{15}N$ HSQC, and HN(CO) from the obtained chemical shift. We defind the secondary structures of both ubl and S5a (PUBS2) parts in the complex. The surface of ubl domain that interacts with S5a (PUBS2) forms a hydrophobic patch involves predominately involves the residues located in the third, fourth, and fifth β-strands. And the surface of S5a (PUBS2) that interacts with ubl domain of hHR23B revealed a hydrophobic surface of the S5a. It was confirmed that these residues from 280 to 298 of S5a (PUBS2) forms a single long helical structure from the chemical shift analysis by CSI and TALOS. This part has an amphiphilic characteristic and the hydrophobic side is assumed to take parts in the complex formation with the hydrophobic patch of the ubl domain. However, the exact 3D structure of its complex is still remained to the elucidated.
세포 내에서 ubiquitin이란 단백질이 다른 단백질을 변형시키는 과정은 단백질 분해 과정, cell-cycle 조절, DNA repair 등 여러 가지 과정에서 중요한 역할을 한다. Multiubiquitin 이 붙은 분해될 단백질은 26S proteasome 에 의해 인식되는데 20S core complex 가 단백질을 분해하고 19S regulatory complex 가 multiubiquitin된 단백질을 인식하는 기능을 한다. 19S 의 한 소단위체인 S5a 가 이 multiubiquitin과 결합을 하고 , hHR23B의 ubiquitin 유사 도메인과도 결합을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 NMR spectroscopy를 통한 구조 분석으로 hHR23B-S5a 의 특이적 결합력을 알아보기 위해 다음과 같은 일련의 연구를 수행하였다.
먼저, hHR23B ubiquitin 유사 도메인을 His-tagged fusion 단백질의 형태로 이를 대장균에서 대량으로 발현시키고 S5a 의 PUBS2 도메인을 GST fusion 단백질의 형태로 대장균에서 대량으로 발현시켰다. 그 후 affinity column 과 size 를 이용한 gel permeation column 을 이용하여 이를 정제하여 동위 원소 탄소와 질소로 레이블 된 99% 이상으로 순수한 단백질을 얻을 수 있었고 이렇게 얻은 단백질을 상호간 결합을 확인하기 위해 pull down assay 를 시행하였고, SDS-PAGE 로 확인한 결과 둘 사이의 결합의 존재를 in vitro 에서 밝힐 수 있었다. 이렇게 확인된 두 단백질의 결합에 대한 원인을 구조적인 관점에서 보기 위해 NMR perturbation 실험을 하였다. 먼저 레이블 된 hHR23B ubl 도메인 에 레이블 되지 않은 S5a 를 과량으로 넣어서 스펙트럼의 변화를 살펴보고 반대로 레이블 된 S5a PUBS2 도메인에 레이블 되지 않은 hHR23B ubl 도메인을 과량으로 첨가하여 스펙트럼의 변화를 살펴보았다. 이로써 변화된 잔기 들이 컴플렉스를 이루는 데 참여한다는 것을 확인할 수 있었다.
두 단백질이 이룬 컴플렉스의 ubl 도메인을 assign 하기 위해 다양한 NMR 실험들을 수행하여 backbone 에 있는 알파, 베타 탄소와 아마이드 질소와 아마이드 수소, 그리고 카보닐 assign 을 위해 CBCA(CO)NH, HNCACB, $^1H-^{15}N$ HSQC, and HN(CO) 스펙트럼을 각각 분석하였다. 또한 컴플렉스의 PUBS2 도메인도 같은 과정을 거쳐 스펙트럼을 분석하여 두 도메인의 2차 구조를 알아내었다. S5a 의 PUBS2 domain 과 결합하는 ubl domain 의 표면은 소수성을 띠고 있으며 ubiquitin의 3차 구조와 비교해 볼 때 이 부분은 3, 4, 5 번째 β-strand 에 해당하는 부분에 속한다는 것을 알았다. 그리고 ubl domin 과 결합하는 S5a PUBS2 domain 의 표면 또한 소수성을 띠고 있다는 것을 알았다. 이 부분에 해당하는 잔기들이 (280-298) 하나의 긴 helical 구조를 가지고 있다는 것을 CSI 와 TALOS 프로그램을 사용하여 확인할 수 있었다. 이 부분이 양쪽성 성격을 띠고 있으며 컴플렉스를 이루는 데 참여한다는 것을 알 수 있었다. 하지만 3차 구조 분석을 통해 정확하게 두 단백질이 이루는 컴플렉스의 구조를 알 수 있을 것이다.
