A method of mutagenic and unidirectional reassembly (MURA) that can generate libraries of DNA-shuffled and randomly truncated proteins was developed. The method involved fragmenting the template gene(s) randomly by DNase I and reassembling the small fragments with a unidirectional primer by PCR. The MURA products were treated with T4 DNA polymerase and subsequently with a restriction enzyme whose site was located on the region of the MURA primer. The N-terminal-truncated and DNA-shuffled library of a Serratia sp. phospholipase $A_1$ prepared by this method had an essentially random variation of truncated size and also showed point mutations associated with DNA shuffling. After high-throughput screening on triglyceride-emulsified plates, several mutants exhibiting absolute lipase activity (NPL variants) were obtained. The sequence analysis and the lipase activity assay on the NPL variants revealed that N-terminal truncations at a region beginning with amino acids 61 to 71, together with amino acid substitutions, resulted in the change of substrate specificity from a phospholipase to a lipase. We therefore suggest that the MURA method, which combines incremental truncation with DNA shuffling, can contribute to expanding the searchable sequence space in directed evolution experiments. A method termed as shuffled reassembly for simultaneous generation of homologous and non-homologous recombination from multiple parents (SHAREMP) was also developed by improving the MURA method. This method involved reassembling the small fragments of each gene group with an appropriate MURA primer, joining two overlapped-MURA libraries, and cloning them by a modified protocol of SHIPREC. The SHAREMP method could produce multiple crossovers without DNA sequence limitations, in which multiple homologous and non-homologous crossovers were found in applying the method to 4 bacterial metalloprotease genes (prtA, aprX, prtB, and prtC). The combination of DNA shuffling and sequence homology-independent recombination was achieved by the SHAREMP method, and thus we could access a more diverse sequence space for directed evolution experiment.
DNA shuffling과 임의의 무작위적인 단일방향 절단에서 나타나는 DNA 형태를 동시에 포함하는 변이체 라이브러리를 제조할 수 있는 MURA (mutagenic and unidirectional reassembly, 돌연변이 유발형 단일방향 재조합) 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 단백질 분자진화를 위한 새로운 유전자 다양성 유발 방법인 MURA는 DNase I 으로의 무작위적 유전자 절단, 단일방향성 primer를 이용한 고온안정성 폴리머라아제 중합반응, T4 DNA 폴리머라아제와 제한효소반응을 순차적으로 이용한다. 포스포리파제 A1 유전자에 대하여 MURA 방법으로 무작위적 N-말단 절단과 DNA shuffling이 동시에 도입된 변이체 라이브러리를 제조한 결과, 의도한대로 기존에 보고된바 없는 새로운 형태의 유전자 다양성을 얻을 수 있었다. 또한 지방질이 유화된 탐색배지에서 라이브러리를 배양하여, 포스포리파제가 리파제로 기질특이성이 변화된 변이체를 얻어내었다. 이들 변이체의 유전자서열 및 포스포리파제/리파제 효소활성을 조사한 결과, N-말단으로부터 61-71사이에 절단됨과 동시에 DNA shuffling이 도입된 변이체가 리파제 활성으로 변화되었음을 알아내었다. 따라서 본 연구에서 개발된 MURA 방법이 무작위적 DNA 절단과 DNA shuffling의 조합된 형태로서, 단백질의 인위적 분자진화 분야에서 매우 활용성이 뛰어날 것임을 확인하였다. 한편, MURA 방법으로부터 분자진화분야에서의 더욱 큰 응용성을 확보하기 위하여 SHAREMP (simultaneous generation of homologous and non-homologous recombination from multiple parents) 방법을 개발하였다. SHAREMP 방법은 다수의 유전자를 그들 유전자서열의 상동성에 제한을 받음이 없이 재조합할 수 있는 방법이며, 두 개의 MURA 라이브러리를 다양한 방법을 이용하여 조합합으로써 상동성/비상동성 재조합을 동시에 도입한 변이체 라이브러리를 제조할 수 있었다. 실제로 4 종의 미생물 프로테아제를 대상으로 SHAREMP 방법을 도입하여 조사한 결과, 기존의 단백질 분자진화 분야에서 보고된 바 없는 새로운 방법으로 다양한 유전자를 재조합할 수 있었다. 본 연구의 MURA 방법과 그를 이용한 효소의 기질 특이성 변화, 그리고 SHAREMP 방법은 단백질 분자진화 분야의 더욱 다양한 응용을 가능하게 할 것이다.
