A lipase gene, lipA, and a lipase-specific foldase gene, lipB of Pseudomonas cepacia KTCT 2966 (recently reclassified as Burkholderia cepacia) were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. Enzymatically active lipase was produced only in the presence of the lipase-specific foldase gene. Because the lipase from Pseudomonas cepacia is widely used in industry as catalyst in organic synthesis, there are many attempts to increase lipase productivity. However, much difficulty has been encountered mainly due to its requirements for lipase-specific foldase. To obtain the lipase variants that do not require the lipase-specific foldase for correct folding, random mutations were introduced to the lipase gene by error-prone PCR, and three lipase variants were selected. Three lipase variants, M3, M5 and M7, showed lipase activities in the absence of the lipase-specific foldase, and all of them have a Y219F substitution seemed important for folding of the lipase. In the absence of the foldase, lipase variants, M3, M5 and M7, showed the specific activities of 0.05, 0.07, 0.16 U/mg respectively, while the LipA did not have lipase activity. Interestingly, M7 variant showed the highest lipase activity, however, when it was expressed with LipB, the lipase activity was not noticeably increased. Amino acid substitutions in M7 variant seemed to participate in the folding of lipase to make it active, and the foldase did not cause a significant change in enzyme activity in M7 variant. Therefore, the possibility of creating an active lipase which does not require the lipase-specific foldase is demonstrated.
Pseudomonas cepacia에서 유래한 Lipase는 유기합성의 촉매로 사용되는 산업적으로 매우 유용한 효소이다. Pseudomonas cepacia lipase가 효소적으로 활성을 갖기 위해서는 lipase의 folding을 돕는 lipase-specific foldase가 필요한데, 이러한 사실 때문에 lipase를 대량생산하는데 많은 어려움과 한계가 있다.
Pseudomonas cepacia KTCT 2966으로부터 lipase (lipA)와 foldase (lipB)유전자를 cloning하여 염기 서열을 분석했으며, Escherichia coli에서 발현시켰다. LipA를 LipB 없이 E. coli에서 발현시키면 lipase 활성을 전혀 보이지 않는다는 것을 알 수 있었다. 이러한 LipA 유전자에 error-prone PCR 을 통해 임의적 돌연변이를 도입한 후 tributyrin agar plate에서의 선별을 거쳐 LipB의 도움 없이도 알맞게 folding되어 효소적 활성을 보이는 것으로 추정되는 변이효소를 확보하였다. 3개의 변이효소 (M3, M5, M7)는 모두 219번째 amino acid가 Tyr에서 Phe으로 치환되었다는 것을 알 수 있었으며, LipB가 함께 발현되지 않아도 이 변이효소들은 각각 0.05, 0.07, 0.16 unit/mg 의 비활성을 갖는다는 것을 확인했다. 특별히 가장 높은 비활성을 보이는 M7 변이효소는 LIpB와 함께 발현될 경우에도 효소의 활성이 급증하지 않는 것으로 나타나 이 변이효소의 치환된 아미노산 잔기들이 lipase folding에 영향을 주어 효소 활성을 갖게 한다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 방향적 분자 진화 방법을 이용하여 foldase의 도움 없이도 효소로서의 활성을 갖도록 알맞게 folding 되는 lipase를 만들 수 있다는 가능성을 보여 주었다.
