Matrix metalloproteinases (MMPs) inhibitors were screened from Metasequoia glyptostroboides and one potent inhibitor, dihydrihinokiflavone (DHHF), a biflavonoid, was selected. DHHF inhibited proliferation of HT1080, human fibrosarcoma cells in a dose-dependent manner. Noncytotoxic levels of DHHF dramatically decreased MMP-9 and MMP-2 production in unstimulated cells, but did not change the level of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-1), an inhibitor of MMP-9. DHHF further inhibited phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced MMP-9 overproduction and proMMP-2 activation. In HT1080 cells, which express wild ?type p53 and Rb, DHHF treatment induced G1 cycle arrest. The G1 arrest in cell cycle progression was associated with a marked decreased in cdk2, cdk4, and phospho-Rb. DHHF increased the levels of p53, a key protein for cell cycle arrest and overexpression if mutant p53 blocked the growth inhibitory effect of DHHF. These results indicate that DHHF inhibits cell growth through p53-dependent pathways. DHHF inhibited critical mediators for cell survival, Akt, phospho-Akt, and Bcl-2. This inhibition was associated with MMP-9 downregulation and partly responsible for G1 arrest. Furthermore, DHHF upregulated phospho-JNK, a key factor for cell death, and increased cell death susceptibility in the presence of hydrogen peroxide. DHHF showed marked inhibition of in vitro HT1080 and B16F10 melanoma cell growth, invasion and motility, and further was effective to inhibit in vivo tumor growth and metastasis. All these results suggest that DHHF can be a good therapeutic compound for anti-tumor including chemoprevention and anti-metastasis.
낙우송과에 속하는 Metasequoia glyptostroboides라는 나무에서 Matrix Metallo-proteinases (MMPs)의 inhibitor를 찾는 과정에서 Dihydro-hinokoflavone (DHHF)이라는 물질을 얻어내었다. DHHF는 플라보노이드의 일종으로서 본 연구에 이용한 HT1080(human fibrosarcoma)세포에서 농도가 높아짐에 따라 세포 증식을 억제하는 현상을 보였다. FACS analysis를 통한 cell cycle 측정결과, DHHF는 세포주기 중 G1기에서 S기로 넘어가는 과정을 억제함으로서 세포 성장을 방해한다는 사실을 알아내었다. G1/S transition에 관여하는 대표적인 조절 인자인 phospho-pRb,cdk2,cdk4등이 DHHF에 의해 억제되는 것을 western blotting으로 확인하여, DHHF가 G1 arrest를 일으킨다는 것을 재확인 할 수 있었다. 이러한 현상이 p53의존적인 것인지를 알아보기 위하여, wild-type과 mutant p53을 과발현시킨 후에 DHHF의 효과를 보았다. Mutant p53 과발현시킨 세포에서는 더 이상 증식억제 효과가 보이지 않았으므로, 이런 현상이 p53의존적임을 알 수 있었다. 더 나아가 이런 현상이 어떠한 신호전달에 영향을 주어 일어나는 것인지 알아보기로 하였다. PI3-K/Akt pathway는 세포의 성장과 전이, 침윤을 매개하는 대표적인 조절 인자 이다. DHHF는 Akt의 단백질 양을 억제하였고, kinase activity가 사라진 mutant Akt와 p85( PI3-K의 subunit )을 과 발현한 세포에서의 MMP 억제 효과를 관찰해보니, 억제 효과가 더 이상 나타나지 않음을 확인하였다. 또한 apoptosis를 매개하는 JNK는 DHHF에 의해 오히려 증가되었다. 이상의 결과를 종합해볼 때, DHHF는 p53-dependent G1 arrest를 유발하며, 이것은 DHHF가 PI3-K/Akt parhway는 억제하나, JNK-dependent cell death pathway는 증가시킴으로서 일어나는 현상임을 알아낼 수 있었다. MMPs는 암세포가 전이하여 정상 조직으로 침윤될 때에 세포 외 기질( Extracellular matrix) 을 분해함으로서 암의 전이 및 침윤을 도와주는 단백질로 알려져 있다. Zymography결과 DHHF에 의해 MMP-2,-9의 발현이 감소되는 것으로 미루어보아, DHHF가 암 전이와 침윤에 억제 효과를 보일 것으로 예상하고 실험을 진행하였다. In vitro invasion assay결과 DHHF는 HT1080세포의 침윤을 억제시켰고, 세포의 움직임도 감소시킨다는 것을 밝혔다(in vitro migration assay). 이러한 영향이 실제 생체 내에서도 효과가 있는지 보기위해 쥐를 이용한 실험을 해보았다. 쥐의 꼬리에 DHHF처리한 암세포를 주입하고 25일 후에 폐를 관찰한 결과 암세포의 폐 전이가 DHHF에 의해 현저히 감소되었고, 쥐 복강에 주사하여 암세포 성장을 관찰한 실험에서도 DHHF에 의해 암세포 성장이 저하되었음을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 세포의 성장과 침윤 그리고 전이를 억제하는 효과가 있음을 입증할 수 있었다.
