Enantiomerically pure (R)-hydroxycarboxylic acids (RHAs) that can be incorporated into bacterial polyhydroxyalkanoates (PHAs) as monomeric units, have great potential as a chiral building block to be widely used in the synthesis of various fine chemicals. For the efficient production of enantiomerically pure RHAs, several chemical and biological depolymerization of bacterial PHA was investigated.
The sort of acid catalyst and the polyhydroxybutyrate (PHB) purification method shows some effects on the efficiency of acidic alcoholysis. When hydrochloric acid was used as an acid catalyst, the initial reactivity can be enhanced especially for the acidic methanolysis of PHB purified by simple digestion method with 0.2N NaOH than that observed when sulfuric acid was used. When 1.2 g of PHB was acidic acoholysed in 4.1 mL of reaction solution consisting 2 mL of 1,2-dichloroethane, 2 mL of methanol, and 0.1 mL of concentrated hydrochloric acid (38%), 84 % of PHB was converted to methyl R3HB in only 15 h of reaction. This rapid and high concentrated reaction will provide the economical profits by decreasing amount of expensive organic solvents and by providing higher productivity.
A heterologous metabolism of PHA biosynthesis and degradation is established in Escherichia coli by introducing the Ralstonia eutropha or Alcaligenes latus PHA biosynthesis operon along with the R. eutropha intracellular PHA depolymerase gene. By using this metabolically engineered E. coli, enantiomerically pure R3HB could be efficiently produced from glucose. By employing a two-plasmids system, developed as the PHA biosynthesis operon on a medium copy number plasmid and the PHA depolymerase gene on a high copy number plasmid, R3HB could be efficiently produced with a yield of 49.5% from glucose. By the integration of the PHA biosynthesis genes into the chromosome of E. coli and by introducing a plasmid containing the PHA depolymerase gene, R3HB could be efficiently produced without plasmid instability in the absence of antibiotics. Continuous R3HB production was also carried out by ultrafiltration membrane cell-recycle continuous fermentation of this stable E. coli system. R3HB can be efficiently produced with specific productivity of 0.28 g R3HB/g cell-h. (R)-3-hydroxyvaleric acid (R3HV) could be also co-produced together with R3HB by culturing metabolically engineered E. coli strains constructed in this study in a defined medium containing both glucose and propionic acid.
The metabolically engineered E. coli systems developed in this study not only provide the method for the efficient production of chiral building blocks, but also provide a good model of metabolic engineering for the production of useful materials.
미생물이 생산하는 폴리머인 폴리하이드록시알칸산(polyhydroxyalkanoate, PHA)의 단량체로 존재하는 광학적으로 순수한 (R)-하이드록시카르복실산((R)-hydroxycarboxylic acid, RHA)은 다양한 정밀화학물질의 합성에 키랄성을 제공하는 전구체로서 광범위하게 사용될 수 있다. 박테리아에 의해 합성되는 PHA를 화학적 또는 생물학적으로 분해하여 광학적으로 순수한 RHA를 효율적으로 생산하는 방법을 살펴보았다.
정제한 폴리하이드록시부탄산(polyhydroxybutyrate, PHB)을 산촉매 존재하에 알코올과 고온에서 반응시켜 PHB를 화학적으로 분해하여 그 단량체인 (R)-3-하이드록시부탄산 ((R)-3-hydroxybutyric acid, R3HB)을 알킬 에스터 형태로 얻는 산 촉매 알코올 분해반응에 있어서 산 촉매의 종류와 PHB를 정제하는데 사용한 정제법에 따라 반응효율이 큰 영향을 받음을 확인하였다. 산 촉매로 기존 문헌상에 보고되었던 황산보다 염산을 사용함으로써 반응 효율을 향상시킬 수 있었는데, 이는 특히 0.2N의 수산화나트륨을 이용한 단순소화법으로 정제한 PHB를 메탄올과 반응시켜 메틸 R3HB를 생산할 때 특히 초기 반응속도가 크게 향상됨을 확인하였다. 반응 용매로 사용된 1,2-디클로로에탄에 대한 비가 기존 문헌에 보고된 것 보다 60배 더 많은 PHB를 염산을 산촉매로 사용하여 메탄올로 고압 분해반응을 수행하였을 때, 단지 15시간의 반응으로 84%의 PHB가 분해되어 메틸 R3HB로 생산됨을 확인하였다. 기존 문헌상에 보고되었던 76시간의 환류 존재하의 상압 분해반응을 수행한 결과와 비교할 때 비록 PHB로부터 생산물인 메틸 R3HB의 수율은 다소 감소하였으나 반응시간의 단축과 함께 값비싼 유기용매 사용을 줄이고, 또한 낮은 가격의 PHB를 사용함으로써 높은 경제적 이득을 얻을 수 있다.
자연계에 존재하는 PHA 생산균주인 랄스토니아 유트로파의 세포내 PHA 분해효소 유전자와 랄스토니아 유트로파 또는 또 다른 PHA 생산균주인 알칼리게네스 레이터스의 PHA 생합성 효소들의 유전자로 구성된 오프론을 함께 원래 PHA 합성하지 못하는 대장균에 도입하여 PHA 합성 및 분해 대사를 갖는 대장균을 제작하였다. 모든 PHA 합성 및 분해 대사 관련 효소 유전자들이 높은 복제수를 가진 플라스미드에 존재하여 발현되는 단일 플라스미드 시스템 (single plasmid system)으로 형질전환한 대장균을 배양함으로써 포도당으로부터 광학적으로 순수한 R3HB가 매우 효율적으로 생산되었으나 일부 합성된 PHB가 세포 내에 남아있어 수율에 다소간 손해를 유발하였다. 이러한 문제는 PHA 생합성 유전자 오프론은 중간 복제수의 플라스미드에 클로닝하고, 세포내 PHA 분해효소 유전자는 높은 복제수의 플라스미드에 클로닝 한 두개의 플라스미드 시스템 (two-plasmids system) 으로 형질전환한 대장균을 사용함으로써 해결할 수 있었으며, 이 시스템의 사용으로 대장균 세포 내에 PHB의 축적없이 30시간 배양만으로 49.5%의 수율로 포도당으로부터 R3HB가 생산되었다.
PHA 생합성 유전자 오프론이 유전체 내에 융합된 대장균을 플라스미드 R1의 hok/sok 유전자로 안정화되고 랄스토니아 유트로파의 세포내 PHA 분해유전자가 클로닝된 높은 복제수의 플라스미드로 형질전환하여 항생제 첨가 없이 배양하여도 모든 외래 유전자들이 손실없이 지속적으로 발현되는 대사공학으로 변형된 대장균을 제작하였고, 이를 초미세 여과막을 이용한 세포재순환 연속배양하여 R3HB를 연속생산할 수 있었다. 이 연속생산에서 R3HB의 비생산속도는 0.28 g R3HB/g cell-h로 매우 효율적이었다. 또한 제작된 대사공학으로 변형된 대장균들의 배양시 포도당과 프로피온산을 동시에 배지에 첨가함으로써 R3HB와 함께 (R)-3-하이드록시발레르산 ((R)-3-hydroxyvaleric acid, R3HV)도 함께 생산할 수 있었다.
이러한 대사공학으로 변형된 대장균의 개발은 키랄전구체로서 유용한 RHA를 효율적으로 생산하는 방법을 제공할 뿐만 아니라 대사공학에 의한 유용물질 생산의 성공적인 모델로서의 의의도 가진다.
