Recombinant Chinese hamster ovary (CHO) cell lines expressing a high-level of human thrombopoietin were developed by transfecting expression vectors into dihydrofolate reductase (DHFR)-deficient CHO cells and subsequent gene amplification in medium containing stepwise increments in methotrexate (MTX) level such as 20, 80, 320 nM. Out of 1800 initial transfectants, 24 parental clones producing a high-level of TPO were selected and subjected to increasing levels of MTX. The expression analysis of 24 clone lineages during gene amplification revealed that the degree of enhancement in expression level varied significantly among clones. However, we found out that the degree of enhancement of the expression level of clones in the increment of MTX from 0 to 20 nM was proportional to that in the stepwise increment of MTX from 0 to 80 nM. Since most clones produced less TPO above 80 nM MTX, the highest producing and stable subclones were isolated at 80 nM MTX. The maximum TPO concentration and $q_{TPO}$ of hTPO in the established subclones with the highest expression level at 80 nM MTX level in batch culture were 10.3 ㎍/ml and $6.1 ㎍/10^6/cells/day$, respectively. The established subclones at 80 nM MTX had $q_{TPO}$ 10 folds higher than the parental clones. Analysis of a clone lineage showed that the reduction of the expression level at 320 nM was mainly due to the decreased growth rate, not due to the reduction of $q_{TPO}$. Southern and Northern blot analyses showed that the enhanced $q_{TPO}$ resulted mainly from the increased TPO gene copy number and subsequent increased mRNA level. Furthermore, TPOs produced from the established clones were biologically active in vivo as demonstrated by its ability to elevate platelet count in treated mice.
To facilitate the establishment of rCHO cell lines with dhfr-mediated gene amplification, a primary selection method based on morphology of parental CHO clones has been developed. Morphology of parental clones that were made by transfecting various plasmids encoding hTPO into dhfr-deficient CHO cells was not uniform. Morphology of many parental clones exhibiting high-level expression of the introduced gene was similar to that of non-transfected, dhfr- CHO cells. On the other hand, most parental clones with low-level expression experienced noticeable morphological changes such as bipolar, fibroblast-like morphology. In case of selection of parental clones with TPO expression level higher than 200 ng/ml, morphological selection improved selection efficiency by 3.5 fold, compared with random selection. Furthermore, when subjected to methotrexate for gene amplification, parental clones selected based on morphology elevated the expression level as much as those selected randomly. Taken together, morphological selection of parental clones can facilitate the establishment of rCHO cell lines expressing recombinant proteins.
To examine the effect of simultaneous calnexin (CNX) and calreticulin (CRT) expression on TPO productivity and quality in rCHO cells, we developed TPO producing rCHO cell line with Doxycycline-regulated CNX and CRT expression. Both CNX and CRT expression level were coordinated and tightly regulated in the dose dependent manner by addition of different concentrations of Doxycycline to culture medium. Overexpression of both CNX and CRT was found to increase the specific TPO productivity $(q_{TPO})$ without growth inhibition and thereby, resulting in the increased level up to 85% in final secreted TPO concentration, probably due to the chaperone-like activity of CNX and CRT in rCHO cells. As for TPO quality, Western blot and IEF analysis showed that simultaneous CNX and CRT overexpression did not induce significant variations in molecular weight and IEF pattern of TPO produced by serum free cultivation, indicating no significant proteolytic processing and prominent glycosylation change of TPO. In addition, any significant changes in in vivo biological activity of TPO were not observed. Take together, the results obtained here demonstrate that $q_{TPO}$ of rCHO cells with the simultaneous overexpression of CNX and CRT can be increased without alteration of TPO quality including biological activity, demonstrating its potential use for a commercial process.
인간 트롬보포이에틴을 대량 발현하기 위하여 Dihidrofolate reductase (DHFR)가 결여된 CHO세포에 발현벡터를 이입한 다음 Methotrexate (MTX)의 농도를 단계적으로 높인 배지에서 배양하여 유전자 증폭을 유도함으로써 산업용 생산세포주를 제조하였다. 1800개의 초기 클론중에 TPO를 고발현하는 24개의 모클론을 선택한 다음 단계별로 MTX처리를 하게 되었다. MTX처리에 의한 유전자 증폭동안 각 클론의 발현증가 정도는 매우 다양했다. 그러나, 순차적인 MTX농도 증가에 의한 유전자 증폭과정에 있어서 0nM에서 20nM로 MTX를 증가시켰을 때 발현양이 증가가 0nM에서 80nM로 증가되었을때의 발현양의 증가와 상관관계가 있음을 발견하였다. 대부분의 클론이 80nM이상의 농도에서 발현양이 감소하였으므로 고발현 안정한 세포주는 이 농도에서 subcloning하여 제조하였다. 회분배양에서 이 세포주의 최대발현양과 비생산속도는 각각 10.3 ㎍/ml 과 $6.1 ㎍/10^6 세포/일$ 이었다. 80nM에서 확립된 세포주는 초기 모클론보다 10배 더 높은 비생산속도를 보였다. 또한, 한 클론 계대의 분석에서 320 nM에서의 발현양의 감소는 비생산속도의 감소가 아니라 성장속도에 기인한다는 것을 밝혔다. 서던블럿과 노던불럿을 통하여서는 증가된 비생산속도가 TPO유전자 복제수와 이로 인한 mRNA의 증가에 기인한다는 것을 보여주었다. 더욱이, 확립된 세포주는 혈소판 증가를 시험하는 동물실험에서 생물학적 활성을 유지하였다.
DHFR 매개된 유전자 증폭과정을 거치는 재조합 CHO세포주의 개발을 촉진시키기 위하여 초기 모클론의 형태에 기초한 일차적인 검색방법이 개발되었다. dhfr유전자가 결여된 CHO세포에 TPO, 항체등 여러종류의 유전자를 암호화하는 플라스미드를 이입하여 제조된 초기 모세포의 형태는 일정하지 않았다. 고발현을 나타내는 초기 모클론들은 형태학적으로 dhfr유전자가 결여된 CHO세포와 유사했다. 한편, 낮은 발현양을 나타내는 클론들은 이극성, 섬유모세포 같은 형태학적 특징들을 보여주었다. 200 ng/ml이상 발현하는 형태학적 선택방법은 초기모세포의 선별에 있어서 무작위 선별보다 3.5배까지의 선별효율을 증가시킬 수 있었다. 더욱이, MTX로 유전자 증폭을 시도하였을 때 형태학적으로 선별된 초기모세포는 무작위 선별된 클론과 유사한 정도의 증폭정도를 나타내었다. 이상의 결과를 종합하면, 초기 모세포의 형태학적 선별은 재조합 단백질을 발현하는 재조합 CHO세포의 확립을 촉진시켜 줄 수 있을 것으로 사료된다.
재조합 CHO세포의 TPO 생산성과 품질에 대한 Calnexin (CNX)와 Calreticulin (CRT)의 동시 발현에 대한 효과를 조사하기 위하여 CNX 및 CRT발현이 독시사이클린으로 조절되는 재조합 CHO세포주를 제조하였다. CNX와 CRT발현은 독시사이클린에 의해 유사하게 작동되었고 용량의존적으로 엄격하게 조절되었다. CNX 및 CRT의 동시발현은 성장속도의 감소없이 TPO의 비생산속도를 증가시켰으며 TPO발현양을 84%까지 증가시켰다. 웨스턴 블럿과 IEF분석은 CNX 및 CRT동시발현이 분자량 및 IEF 패턴에서 유의적인 변화를 보이지 않았음을 보여주었으며 이는 단백질 가수분해나 당쇄구조의 거시적 변화는 발생하지 않음을 시사해 준다. 더욱이, 생물학적 활성에서도 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 이상의 결과를 종합할 때 CNX 및 CRT의 동시발현은 생물학적 활성 같은 TPO의 품질을 변화시키지 않으면서 재조합 CHO세포의 비생산속도를 증가시킬 수 있으므로 산업적 생산공정에 활용될 수 있을 것으로 사료된다
