The accumulation of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum (ER) elicits an ER-to-nucleus signaling pathway known as the unfolded protein response (UPR) in eukaryotes. In yeast, Ire1p, a kinase/endoribonuclease in the ER membrane, plays as a key proximal sensor molecule in the UPR signaling. To elucidate the molecular mechanism involved in the unfolded protein response in plant, I isolated two cDNA homologs of IRE1 gene from Arabidopsis (AtIRE1a, AtIRE1b). The two IRE1 homologs were predicted to encode type I transmembrane proteins, which contain lumenal domain at N-terminal halves and a kinase/endoribonuclease domains at their C-terminal halves. The expressions of the two genes were detected in various organ tissues of the Arabidopsis plant in Northern blot analysis. Using GST-fused recombinant protein, it was demonstrated that the C-terminal half of the AtIre1a protein has in vitro autophosphorylation activity. However, I could not detect endoribonuclease activity of the AtIre1a protein when I used yeast HAC1 RNA as a substrate in vivo in transient expression using Arabidopsis protoplast.
As an attempt to find the UPR-regulated genes in Arabidopsis by overall genome scale, I have performed the gene expression analysis using oligonucleotide genome array, which contains probes against more than 8,200 genes and 100 EST clusters for Arabidopsis thaliana. From the Northern analysis, optimized condition for the tunicamycin treatment to Arabidopsis seedlings were established, that is 5㎍/ml$ tunicamycin treatment for 4 hr. Through gene expression profiling experiments using 4 genechips for mock-treated control and 4 genechips for tunicamycin(Tm)-treated respectively, 32 genes, which occupies 0.4 % of the tested total genes, were revealed as tunicamycin-upregulated. Among them, ER chaperones such as BiPs, protein disulfide isomerases, calnexins, some of heat-shock proteins working in the ER lumen, calreticulins, and the genes involved in protein transport such as Sec61γ, Sar1B, and coatamer subunit were included. Also, 4 genes encoding the proteins involved in amino acid biosynthesis/metabolism were found as Tm-inducible, which is similar to the mammalian microarray result. ER $Ca^{2+}$ -ATPase, important for ER $Ca^{2+}$ homeostasis was also shown under UPR control. Thus, the overall feature of the UPR-target genes is similar to yeast in some aspect and also resemble to mammals in another aspect. 25 genes were postulated to decrease their RNA transcripts by tunicamycin-treatment. The list of Tm-downregulated genes includes 5 chitinase genes, 6 oxidase genes, and 3 genes encoding cell-wall degrading enzymes, while most of them seem to be secreted to extracellular space.
Some of the UPR-target genes (for upregulated genes, CNX1, BiP-L, $HSP70_{ER}$, $HSP90_{ER}$ and for down-regulated genes, endochitinase and salt-tolerance zinc finger protein) were confirmed by Northern blot analysis. Furthermore, the transcriptional activities of UPR-target genes (BiP, PDI, CNX1, CRT1, CRT2, BiP-L, Sar1B, and Sec61γ) were verified further by promoter analysis and their sequences recruited from genome database were surveyed whether they may contain any kind of cis-elements studied in mammals (ERSE-1, ERSE-II, and XBP1 binding site). Finally, I could find that all of these 3 UPR-responsible cis-elements functional in higher eukaryotes might exist and well-conserved in Arabidopsis. On the basis of the results, I propose that the similar signaling mechanisms with those elucidated in mammals may exist in plant.
세포 환경의 변화로 인해 소포체 (ER) 에서 단백질의 폴딩과 가공 과정이 방해를 받게 되면 소포체에 스트레스가 발생하며, 심할 경우 세포는 치명적인 손상을 받게 된다. 이러한 소포체 스트레스의 원인 중 하나는 소포체 내부에 폴딩이 제대로 되지 않은 단백질들이 축적될 때 생긴다. 모든 진핵 세포는 이 스트레스를 제거하려는 세포내 신호전달 기구를 지니고 있는데, 이를 소포체 스트레스 반응 (ER stress response) 혹은 UPR (unfolded protein response) 이라고 한다. 효모의 경우, 소포체 막 단백질인 Ire1p가 unfolded protein의 ER 내 축적을 감지하여 핵으로 신호를 보내는 중요한 역할을 수행한다. 식물에서의 UPR 신호전달의 분자 기작을 밝히기 위해, 애기장대에서 효모 IRE1과 유사한 두 가지 유전자를 분리해 내고 각각 AtIRE1a, AtIRE1b 라고 명명하였다. 이들 두 유전자로부터 만들어 지는 단백질은 각각 841개, 881개의 아미노산으로 구성되었으며, N-terminal half에 luminal domain을 C-terminal half에 kinase domain과 RNase domain을 갖는 type I transmembrane 단백질인 것으로 예측되었다. Northern 분석을 통해서 이들 유전자들이 식물의 각 조직에서 전반적으로 발현되고 있음을 확인하였다. 대장균을 통해 합성한 GST-fused 재조합 단백질을 이용하여 AtIre1a의 C-terminal domain 이 protein kinase 활성을 가지고 있음을 in vitro autophosphorylation 실험을 통해 증명하였다. 그러나 애기장대 원형질체를 이용한 in vivo transient expression 실험에서는 tunicamycin 처리를 통한 UPR 유도나 AtIRE1 유전자의 과발현에 의해 효모의 HAC1 RNA가 splicing 되는 것을 확인하지는 못했다. 또한 AtIRE1 유전자들을 원형질체에 과발현 시켰을 때, 그 자체만으로 BiP 프로모터의 활성을 증가시키지 못했다.
애기장대에서 UPR에 의해 발현이 조절되는 유전자를 게놈 스케일로 탐색하기 위해, 8,200 개 이상의 애기장대 유전자에 대한 probe를 포함하고 있는 올리고 유전자 칩을 이용하여 tunicamycin 처리로 UPR을 유도한 식물에서 유전자 발현을 탐색하였다. 그 결과, 약 0.4%에 해당하는 32개의 유전자가 Tm 처리로 인해 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 그 중에는 소포체 chaperone 유전자인 BiP, PDI, calnexin, calreticulin, HSP70ER, HSP90ER 등과 단백질의 이동에 관여하는 유전자인 Sec61, Sar1B, coatamer 등이 포함되어있었다. 또한 아미노산 생합성 및 대사에 관여하는 4개의 유전자들과 ER $Ca^{2+}$ -ATPase도 UPR에 의해 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 25개의 유전자들이 UPR에 의해 RNA 양이 감소하는 것으로 조사되었다. 발현이 감소하는 유전자들 중에는 5개의 chitinase관련 유전자들, 6개의 oxidase관련 유전자들, 3개의 세포벽 분해 관련 유전자들이 포함되어있었다. UPR에 의해 발현이 조절되는 몇 가지 유전자들; CNX1, BiP-L, $HSP70_{ER}$, $HSP90_{ER}$, endochitinase, salt-tolerance zinc finger protein, 에 대해서 Northern 분석을 통해 RNA level에서 발현 변화를 증명하였다. 또한 발현이 증가하는 7개의 유전자들에 대해 프로모터 분석을 통해 실제로 이들 유전자들이 전자 수준에서 발현이 증가함을 증명하였다. 그들 프로모터의 염기서열을 분석하여 포유류에서 연구된 3개의 UPR-responsible cis-element 인 ERSE-I, ERSE-II, XBP1-binding site가 식물에서도 존재하며 잘 보존되어있음을 확인하였다.
