Physiological and environmental characteristics of succinate-producing Actinobacillus succinogenes sp. 130Z were studied to develop the efficient biological system for succinic acid production. High cell density culture system by external membrane recycle bioreactor was also developed. In high-cell concentration cultivation of Actinobacillus succinogenes, volumetric productivity of succinic acid reached over 6.5 g/L/h.
Several factors which affect cell growth and succinic acid production were examined by 100 ml flask and 1L batch cultures. Specific growth rates in the flask cultivation were almost same with increasing glucose concentration up to 40 g/L glucose, but slightly decreased when 80 g/L glucose was used. Cell growth and succinic acid production were also affected by initial pH in flask cultivation. The range between pH 7 and pH 7.5 was the best condition on a view of cell growth and succinic acid production. But the succinic acid yield between pH 6 and pH 6.5 showed higher results than the data between pH 7 and pH 7.5. Other carbon sources including lactose, sucrose, maltose, fructose, mannitol and mannose could be utilized as alternatives to glucose. Among the eight different complex nitrogen sources, only soytone could be utilized for succinic acid production. Magnesium carbonate in the medium could increase succinic acid production. In 1 L batch cultures, volumetric productivity of succinic acid increased when more yeast extract was used. With 60 g/L glucose and 5 g/L yeast extract, cells grew up to $OD_660$ (optical density) of 3.5 and succinic acid productivity reached 0.46 g/L/h. When 60 g/L glucose and 25 g/L yeast extract were used, cell concentration was over $OD_660$ of 9 and succinic acid productivity reached 1.34 g/L/h. Cell concentration and the amount of succinic acid attainable were not dependent on the concentration of phosphorous sources in the medium. Effects of external supply of $H_2$ were examined. The optimum ratio of $H_2/CO_2$ was 5:95 % (v/v) on a view of productivity of succinic acid when 30 g/L glucose was used. In this condition, succinic acid productivity and yield were 1.45 g/L/h and 60%, respectively. The distribution of the fermentation products was not affected by varying culture conditions in a reasonable range.
In order to develop the biological system for high-productivity succinic acid production, fed-batch cultures were examined. By constant feeding, cells grew up to $OD_660$ of 6 and succinic acid productivity was 1.17 g/L/h, however, the productivity decreased as culture time went on. By intermittent feeding, cell concentration couldn't reach $OD_660$ of 4. These experiments indicated the fed-batch cultivation couldn't be a suitable strategy for high-productivity succinic acid production.
In the flask cultivation, the inhibition of formic acid, one of the byproducts produced by Actinobacillus succinogenes, was examined. Therefore, in order to remove toxic products during fermentation and develop high cell density culture system of Actinobacillus succinogenes, continuous cultivation using external membrane recycle bioreactor was studied. By this system, cell concentration reached $OD_660$ of 27 and succinic acid productivity reached over 6.5 g/L/h. Interestingly, metabolic pathway and product change were found during high cell density culture by Actinobacillus succinogenes. When DCW was over 10-15 g/L, succinic acid wasn't produced any more, lactic acid became a major product. By this pathway, cell concentration reached over $OD_660$ of 200, lactic acid concentration approached 60g/L. Additionally, the investigation of succinic acid fermentation kinetics by Actinobacillus succinogenes resulted in a successful model. The model was found to be applicable to most of existing data with batch and cell recycle cultures and was in good agreement with Luedeking-Piret equation for product-formation kinetics. Consequently, this study provides original information about physiological and cultural features, external membrane recycle cultivation by Actinobacillus succinogenes sp. 130Z.
숙신산(succinic acid)은 4개의 탄소로 이루어진 dicarboxylic acid로서 TCA 회로의 중간대사산물이며 많은 동식물과 미생물 내에 미량으로 존재하는 화학물질이다. 숙신산이나 그 유도체들은 생분해성 플라스틱, 식품, 의약품 및 화장품산업 등에서 광범위하게 이용되고 있으며 현재 화학적인 합성법으로 주로 생산된다. 그러나 현재는 보다 환경친화적인 생물학적 발효에 의한 숙신산 생산이 각광을 받고 있다. 발효에 의한 숙신산 생산의 경우 값싼 재생자원을 원료로 사용할 수 있고 이산화탄소를 원료로 사용하므로 보다 환경친화적인 장점이 있다.
본 연구에서는 효율적인 숙신산 발효 시스템을 개발하기 위해 높은 생산성을 보이는 생물학적 숙신산 생산에 대한 연구를 통성혐기성 균주인 Actinobacillus succinogenes sp. 130Z를 이용하여 수행하였다. 먼저 균주의 생리학적 및 배양학적 특성에 대한 실험을 플라스크와 회분식 배양을 이용하여 수행하였다. 이산화탄소와 $MgCo_3$ 의 공급은 균주의 성장 및 숙신산 생산을 증가시켰다. 초기 포도당을 40 g/L까지 사용했을 때는 균주의 비성장속도가 저하되지 않음을 발견했고 80 g/L가 사용되었을 때 약간 저하됨을 발견했다. 경제적인 배지의 디자인을 위해 기존의 yeast extract와 포도당과 다른 질소원과 탄소원을 탐색한 결과 soytone이 질소원으로 사용될 수 있었고 fructose, lactose 등의 탄소원을 발견할 수 있었다. 높은 포도당 농도가 사용되었을 때 숙신산의 생산성을 높이기 위해서는 높은 농도의 yeast extract가 필요했다. 외부의 수소 기체 공급을 통해서 균주의 성장과 숙신산 생산성을 높일 수 있었다.
고생산성을 가진 숙신산 발효 시스템의 개발을 위해 constant 기질 공급방법과 exponential 공급방법을 이용한 유가식 배양을 수행하였다. 그러나 유가식 배양에서는 균주의 성장과 숙신산 생산이 회분식에 비해 크게 증가하지 않아 외부 재순환 연속공정을 숙신산 발효에 도입하여 수행하였다. 외부 재순환 공정에서는 균주의 성장이 $OD_660$에서 27이고 숙신산 생산성이 6.63 g/Lh에 달해 회분식 배양에 비해 획기적으로 향상된 생산성을 가진 발효 시스템임을 알 수 있었다.
숙신산 발효의 동적 거동을 잘 모사할 수 있는 모델을 개발하기 위한 모델링을 수행하였다.
개발된 모델은 60 g/L 포도당을 이용한 회분식 배양과 재순환 공정에 대한 실험 데이터와 거의 일치하는 경향을 보였다.
결론적으로 본 연구는 아직 그 생장특성이 명확히 밝혀지지 않은 통성혐기성 숙신산 생산 균주인 Actinobacillus succinogenes sp. 130Z에 대한 배양학적 특성에 대한 기초 자료와 그 유가식 배양, 외부 재순환 연속 배양에 대한 기초 자료를 제공하며 숙신산 생산의
동적 거동에 대한 기초적인 모델을 제시한다.
