In ER stress conditions, the levels of molecular chaperones and folding enzymes in the endoplasmic reticulum (ER) are controlled by a transcriptional induction process termed the unfolded protein response (UPR). ATF6, a member of the leucine zipper transcription factor family, can constitutively induce the promoter of glucose regulated protein genes through activation of the ER stress element (ERSE). When ER stress is induced, ATF6 is activated by protease-mediated cleavage and activates ERSE-mediated transcription to survive under ER stress conditions that cause continuous accumulation of unfolded proteins in the ER. During viral infection, host cell must be protected from ER stress so that virus can maintain stable viral life cycle. Because if cells are not able to endure ER stress, they set up a signal transduction pathway toward apoptosis, virus should take necessary action to keep host cells alive. The human papillomavirus E6 is recognized as potent viral oncogene and is associated with malignant tumor formation. In this present study, we deciphered whether UPR can be induced by viral infection and can be modulated by expression of viral oncogene. E6 activated ERSE specific promoter (Grp78 promoter) in transient transfection assay. In contrast, other HPV genes such as E2 and E7 did not activate Grp78 promoter. In addition, E6 of high-risk, especially HPV16 E6 augmented Grp78 promoter activity strongly while E6 of low-risk group, if any, activated it slightly. Using biochemical approaches, E6 did bind to ATF6 in vitro and in vivo, and the bZIP DNA binding region of ATF6 is significant for interaction with E6. In addition, transformation defective mutant HPV-16 E6 did not activate Grp78 promoter, indicating that structural integrity of E6 is important for its oncogenic potential and the ATF6-mediated UPR induction. From these data, we conclude that E6 activates UPR induction and protein-protein interaction between E6 and ATF6 may be significant for maintaining viral latency.
소포체는 생체 내 단백질이 번역되어 수송되고 활성이 있는 성숙한 단백질로 만들어지는 과정을 담당하고 있는 세포 내 기관이다. 이러한 소포체가 독성을 유발할 수 있는 세포 내 환경이나 약물에 의해 스트레스를 받게 되면 세포는 unfolded protein response(UPR) 라는 기전에 의해 단백질 접힘을 담당하는 각종 효소와 chaperone등의 전사활성을 촉진시켜 스트레스에 의해 쌓이게 되는 잘못 접힌 단백질을 처리하게 된다. ATF6는 소포체막에 불활성화된 상태로 발현되며 UPR 신호에 의해 활성화되는 단백질 분해효소에 의해 절단되어 373개 정도의 아미노산으로 구성된 전사활성이 있는 아미노 말단 쪽의 단편이 핵으로 이동하여 Grp78 과 같은 chaperone의 전사를 활성화시키게 된다. Grp78 등 UPR에 의해 유도되는 단백질의 프로모터 부위에는 ER stress element (ERSE)라는 염기서열 단위가 있어서 활성화된 ATF6가 이 부위에 결합하여 Grp78의 전사를 촉진시키게 된다. 세포가 바이러스에 감염되게 되면 여러 가지 세포 내 환경이 변화되고 ER의 기능과 역할이 항진되어 ER stress를 받게 되며 이것이 심해지면 세포는 예정사하게 된다. 따라서 바이러스의 측면에서는 이러한 세포 내 환경을 극복하는 것이 바이러스의 생활사를 유지시키는 데 필수적이다. 사람 파필로마바이러스의 고위험군E6 단백질은 E7과 함께 이 바이러스가 숙주세포를 악성 종양 세포로 암화시키는데 필요한 단백질이다. 본 연구의 목표는 세포의 UPR이 바이러스의 감염과 이에 따른 암발생 유전자의 발현에 의해 촉진될 수 있는 지를 알아봄과 동시에 이러한 과정이 바이러스가 숙주세포를 암화 시키는 데에 어떤 기여를 할 수 있는지를 고찰하는 것이었다.
우리는 이를 밝히기 위해 tunicamycin을 처리해 인위적으로 세포에 소포체 스트레스를 유발시키고, 이에 Grp78 프로모터에 의해 전사가 조절되며 lucferase를 발현하는 합성 reporter plasmid를 여러 가지 조합의 암발생 단백질을 발현하는 유전자와 함께 도입하여 전사활성 변화를 관찰하였다. 그 결과 E6, 특히 고위험군인 16E6에 의해서만 특이적으로 Grp78 프로모터의 전사능력이 변화하는 것으로 나타났다. 이것은 Grp78 프로모터가 가진 ERSE 염기서열에 특이적으로 결합하는 전사활성 인자를 매개로 하여 일어나는 현상으로 추측하고, 이러한 전사활성 인자 중 포유류 UPR에서 가장 중요하다고 알려진 ATF6를 E6 단백질의 목표 단백질로 정하여 여러 가지 결합 실험을 해 보았다. 그 결과 시험관 내 혹은 생체 내에서 활성화되어 핵으로 수송된다고 알려진 ATF6(1-373)와 E6의 결합을 확인하였고, 결합 강도 역시 16E6가 다른 저위험군 E6(6b, 11)와 18E6에 비해 큰 것으로 나타났다. 또한 ATF6(1-373)의 구조 중 bZIP도메인이 이 결합에 중요하다는 것을 GST pull-down 실험을 통해 확인하였다. 우리는 형질전환 기능에 결함이 있거나 없는16E6 돌연변이 유전자로도 Grp78 프로모터의 활성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과 zinc finger 모티프에 결함이 있는 형질전환 기능 결함 16E6는 와일드 타입 16E6와 그렇지 않은 돌연변이16E6에 비해 이러한 기능이 현저히 떨어져 있는 것을 알 수 있었다. 이것은 16E6의 온전한 구조가 UPR 유도에 중요한 요소임을 반증하는 것이다. 이러한 결과로부터 사람 파필로마 바이러스의 암발생 단백질인 E6는 세포가 소포체 스트레스를 받은 상황에서, UPR을 촉진시켜서 세포가 예정사로 가지 못하게 함으로써 암세포 형성에 기여한다고 할 수 있다.
