In an attempt to increase the specific thrombopoietin (TPO) productivity $(q_TPO)$ of recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cells (TPO-33), effect of expression level of ERp57, an isoform of protein disulfide isomerase, on $q_TPO$ was investigated. To regulate ERp57 expression level, the Tet-Off system was first introduced in TPO-33 cells and stable Tet-Off cells (TPO-33-Tet-Off) were screened by the luciferase assay. The rCHO cells with doxycycline-regulated ERp57 expression system (TPO-33-ERp57) were obtained by co-transfection of pTRE-ERp57 and pTK-Hyg expression vectors into TPO-33-Tet-Off cells and subsequent screening by Western blot analysis of ERp57 and an enzyme-linked immunosorbent assay of secreted TPO. Western blot analysis showed that ERp57 expression level in TPO-33-ERp57 cells could be regulated tightly by the addition of different concentrations of doxycycline to a culture medium. The doxycycline concentration of 1㎍/mL, which did not influence cell growth and TPO production of TPO-33-Tet-Off cells, was high enough to suppress the ERp57 expression to a basal level. Compared with the basal level, a 1.7-fold increase in ERp57 expression level was obtained in the absence of doxycycline. This increased expression level of ERp57 resulted in a 2.1-fold increase in $q_TPO$ without growth inhibition, probably due to the chaperone-like activity of ERp57 in CHO cells. Taken together, the results obtained here demonstrate that $q_TPO$ of rCHO cells can be increased by elevating the expression level of ERp57.
트롬보포이틴은 최근에 밝혀진 혈액 성장 호르몬 중의 하나이며, 트롬보포이틴의 cDNA는 돼지, 토끼, 사람 등 여러 동물에서 클론되었다. 생산된 단백질은, 분비 과정에서, 수많은 chaperone과 효소의 다양한 속도 결정 단계를 가진다. ER의 내막에는 단백질 생합성과 folding에 영향을 미치는 많은 종류의 chaperone 들이 존재한다. PDI 단백질은 chaperone으로 작용하여, ER내의 잘못된 형태의 단백질을 교정하는 것으로 밝혀졌다. ERp57은 57 kDa의 단백질로서, PDI의 종류 중 하나이다. ER 내의 chaperone을 과 발현 시켜 영향을 알아본 사례는 여럿 있다. 이는 목적 단백질, 사용한 세포 종류, 과 발현한 chaperone의 종류에 따라 다르다. 여러 연구 결과 중, CHO 세포에서 ERp57의 발현 량을 증가시킨 예는 없었다. 트롬보포이틴을 생산하는 재조합 CHO 세포에서 생산성 증가를 위해, ERp57 단백질의 발현량을 조절하여, 생산성에 미치는 영향을 조사하였다. ERp57 단백질의 발현량을 조절하기 위해, 테트라사이클린(독시사이클린)으로 조절되는 시스템을 사용하였다. 안정된 독시사이클린 반응 세포 주를 확립하기 위하여 luciferase assay를 시행하였다. 독시사이클린으로 ERp57의 발현 량을 조절하는 세포주는 pTRE-ERp57 벡터와 pTK-Hyg 벡터로 만들어졌다. Western blot analysis와 ELISA를 통해, ERp57 단백질과 트롬보포이틴을 각각 정량 하였다. Western blot analysis는 TPO-33-ERp57 세포 내에서 ERp57 발현량이 독시사이클린의 다양한 농도에 따라 엄격히 조절된다는 것을 밝혔다. 대조군 세포 (TPO-33-Tet-Off)에서는 1㎛/mL 의 독시사이클린의 농도에서 세포의 성장이나 트롬보포이틴의 생산성에 아무런 영향을 미치지 않았다. 1㎛/mL 으로 충분히 ERp57의 발현 량을 최하까지 조절할 수 있었으며, 독시사이클린이 없는 배지에서 가장 많이 발현된 양의 ERp57의 양은 최저 발현량 (대조군)에 비해 1.7배로 얻어졌다. 이러한 ERp57 발현 수준의 증가는 2.1배의 트롬보포이틴의 생산량 증가를 야기시켰으며, 이는 ERp57의 chaperone과 같은 작용에 의해 이루어졌을 것이다. 따라서, 재조합 CHO 세포 주에서 ERp57의 발현 량 증가는 트롬보포이틴의 생산성 증가를 증명하였다.
