M1 RNA, the catalytic component of Escherichia coli RNase P, is derived by 3` processing from pM1 RNA, a major transcript of the rnpB gene. This 3` processing occurs by two pathways involving multiple steps. The pM1 RNA molecule has an rne-dependent site downstream of the processing site, GAUUU, whose sequence variation affects the processing efficiency. In this thesis, first, roles of the sequence of the rne-dependent site on the pathways of 3` processing of M1 RNA were examined. The results showed that the primary sequence itself of the rne-dependent site possessed the ability to determine the processing pathways. Therefore, the sequence of the rne-dependent site seems not only to affect the processing efficiency, but also to guide the RNA metabolic pathway. The sequence of the rne-dependent site also affected the substrate specificity by generating the processing products at one nucleotide upstream or downstream from the normal cleavage sites. Interestingly, in case of the variants involving both pathways, the same 3`-ends were generated by either pathway, suggesting that the substrate specificity by both pathways is same. These results may provide a mechanistic basis for the role of the rne-dependent site in control of biosynthesis of M1 RNA in E. coli.
Although this 3` processing of M1 RNA has been known to be carried out by RNase E, no one has shown the direct involvement of RNase E in the processing. RNase E is an essential endonuclease, which was initially characterized as an enzyme responsible for the generation of 5S rRNA from a 9S RNA precursor. RNase E is also the main component of an mRNA degradation complex, the degradosome. The N-terminal half of RNase E containing the ribonucleolytic site is sufficient for the cleavage of 9S RNA. In this thesis, whether or not RNase E is directly involved in 3` processing of M1 RNA was examined by using the N-terminal half of RNase E. Indeed, the N-terminal half of RNase E cleaved pM1 RNA endonucleolytically. However, the cleavage by RNase E occurred at the site one nucleotide downstream from the site generated by a partially purified cell extract of ASP-40. In addition, the mutations at the rne-dependent site affected the cleavage efficiency by RNase E.
Polyadenylation controls mRNA stability in prokaryotes, eukaryotes, and organelles. In E. coli, poly(A) tails reduce the stability of regulatory plasmid RNAs and of mRNAs. Although polyadenylation of stable RNAs in E. coli was also observed, its biological function is yet unclear. M1 RNA is one of stable RNAs in E. coli, and derived by 3` processing from pM1 RNA. However, the biological significance of this 3` processing event has been overlooked mainly because the unprocessed pM1 RNA has the same activity of M1 RNA in vitro. In this thesis, a possible role of the 3` processing was examined. pM1 RNA was polyadenylated with its accumulation when the 3` processing was blocked, and this polyadenylation reduced the stability of pM1 RNA. On the other hand, the stability of M1 RNA was independent of the poly(A)-dependent RNA degradation. These results suggest that 3` processing of M1 RNA is essential for protection against RNA degradation.
M1 RNA는 tRNA의 5` 말단을 성숙시키는 대장균 RNase P의 RNA 성분으로 rnpB 유전자의 주 전사체인 pM1 RNA로부터 3` 말단의 가공과정을 거쳐 만들어진다. 3` 가공과정은 여러 단계를 거치는 두 가지 경로를 통하여 일어난다. pM1 RNA는 절단위치의 3`에 밀접하여 있는 GAUUU의 rne 의존위치를 가지는데 그 염기서열은 가공 효율에 영향을 미친다. 본 연구에서는 rne 의존위치의 염기서열이 M1 RNA 3` 가공과정 경로에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 rne 의존위치의 염기서열 자체가 가공경로를 결정하는 역할을 할 수 있음을 보였다. 따라서, rne 의존위치의 염기서열은 가공 효율에 영향을 미칠 뿐 아니라 RNA의 대사 경로를 조정하는 역할을 할 수 있을 것으로 보인다. rne 의존위치의 염기서열은 정상 절단위치로부터 한 염기 위 혹은 아래 위치가 잘린 가공생성물을 만들어냄으로써 기질 특이성에도 영향을 미쳤다. 흥미롭게도 두 가지 가공경로를 통해 만들어진 생성물이 같은 3` 말단을 보였으며, 이는 두 가공경로가 같은 기질 특이성을 나타냄을 보여준다. 이러한 결과들은 대장균 M1 RNA의 생합성을 조절하는 데 있어서 rne 의존위치의 역할에 대한 근거를 제시하고 있다.
M1 RNA의 3` 가공반응이 RNase E에 의해 일어날 것이라고 알려져왔지만 직접적인 근거는 제시된 바 없다. RNase E는 세포의 생장에 필수적인 endoribonuclease이며, 9S RNA 전구체로부터 5S rRNA를 만들어내는 효소로 처음 알려졌다. 최근에는 mRNA의 분해 복합체인 degradosome의 주 요소로 알려졌다. 또한, RNase E는 N 말단부위만으로도 9S RNA의 절단반응이 가능하다는 것이 알려졌다. 본 연구에서는 pM1 RNA가 RNase E의 N 말단 부위에 의해 endonucleolytic 하게 잘림을 보임으로써 RNase E가 M1 RNA의 3` 가공과정에 직접적인 역할을 함을 보였다. 그러나, RNase E에 의한 절단 위치는 세포 추출물에서의 절단 위치와 한 염기 다르게 나타났다. 또한, rne 의존위치의 염기서열이 RNase E의 절단 효율에 영향을 주었다.
원핵생물과 진핵생물, 세포 소기관에서 polyadenylation은 mRNA의 안정성을 조절하는 역할을 한다. 대장균에서 poly(A) 꼬리는 플라스미드 조절 RNA와 mRNA의 안정성을 감소시킨다. 안정한 RNA들의 polyadenylation 또한 관찰된 바 있지만, 그 생체내 역할은 알려져 있지 않다. M1 RNA도 일종의 안정한 RNA이며 전구체 pM1 RNA로부터 3` 가공과정을 거쳐 만들어진다. 그러나, pM1 RNA가 M1 RNA와 같은 활성을 가짐이 알려져 있어서 3` 가공과정의 생물학적 중요성은 간과되어왔다. 본 연구에서는 3` 가공과정이 막힘으로써 전구체 RNA가 세포 내에 축적되면 polyadenylation됨을 보였고, polyadenylation에 의해 안정성이 줄어듬을 보였다. 반면 가공과정을 거친 M1 RNA는 polyadenylation에 관계없는 안정성을 보였다. 이는 M1 RNA의 3` 가공과정이 RNA 안정성을 위해 필요함을 의미한다.
