The hepatitis B virus X protein (HBx) is highly linked with liver diseases and the development of hepatocellular carcinoma. A novel protein, designated as HBx-interacting protein (XIP), has been shown to abolish the transactivation functions of HBx. Under physiological conditions, XIP was composed mainly of random-coils; however, in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS) the helical population increased up to 40 %. The secondary structure of XIP was determined with the chemical shift index method using heteronuclear multidimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy in the presence of SDS. Analysis identified cx-helices that included amino acid 8 to 12, 32 to 38, 42 to 54 and 82 to 91. XIP deletion mutants were synthesized and used in in vitro binding assays. The results of these experiments indicated that nearly the entire sequence of XIP is required for binding to HBx and that truncation of the cc-helices in XIP reduced the overall helicity of the protein more than expected by the extent of the truncation. These results imply that the deletion of a portion of a-helix affects the formation of other helical segment in the presence of SDS and that the compact folding of XIP may be necessary to generate functional protein-protein interaction surfaces.
Preparation of HBx was attempted. Several versions of fusion proteins were constructed such as polyhistidine-tag, glutathione S transferase, thioredoxin and maltose binding protein (MBP) fusions. Except MBP-X, all of fusion proteins were overexpressed as inclusion bodies. Histagged HBx was refolded in acidic pH. However, ATPase assay proved that the refolded protein did not have a functional activity. Although MBP-X was soluble, light scattering measurement indicated that the protein existed as soluble aggregates. Moreover, MBP-X was not found to interact with XIP. The forced monomerization of MBP-X was not sufficient to recover the activity of HBx. Oxidative refolding was performed on MBP-X, and a monomeric MBP-X was produced by this approach. However, the interaction between the refolded MBP-X and XIP was not verified.
Tenecin 3, an antifungal protein, previously isolated from the insect Tenebrio molitor, inhibits growth of the fungus Candida alb/cans. However, the antifungal mechanism and functions of tenecin 3 remain unknown. As an initial step to study the mechanism and functions, physical and structural properties of tenecin 3 were examined by circular dichroism (CD) analysis and 2D nuclear overhauser effect spectroscopy. These analyses suggest that tenecin 3 has a propensity of random structure with very loose turn-like elements. The CD results also indicate that this random structural propensity is not significantly affected by temperature, pH, and by the presence of organic solvents or sodium dodecyl sulfate micelles. However, the hydrodynamic studies suggest that tenecin 3 is not in extended form in spite of its random structural feature.
간염 B 바이러스의 X 단백질(HBx)은 간질환과 간암의 발병에 밀접한 연관을 가지고 있다. X 결합 단백질(XIP)이라는 새로운 단백질이 X 단백질의 활성을 억제하는 것으로 알려졌다. 생리학적 조건에서 XIP는 주로 random coil로 구성되어 있었으나, sodium dodecyl sulfate (SDS)에 의해서 helix의 비율이 전체의 40%까지 증가하였다. SDS가 들어 있는 조건에서 이핵 다차원 NMR 분광법을 이용한 chemial shift index 기법으로부터 XIP의 이차구조를 구하였다. Helix는 8-12, 32-38, 42-54 및 82-91 아미노산 서열 사이에 형성된 것으로 확인되었다. XIP에 대한 여러 결실 돌연변이 단백질을 만들어, in vitro 결합 분석 실험에 이용하였다. 어느 결실 돌연변이 단백질이라도 HBx에 결합하지 않았으며, helix 해당부분이 소실되면 소실된 정도보다 더 helix의 비율이 줄어드는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 SDS가 존재하는 조건에서 어느 한 부분의 helix가 소실되면, 다른 부위의 helix의 형성에도 영향을 주며, XIP의 잘 짜인 구조형성이 제대로 된 단백질 상호작용을 만들어낼 수 있음을 암시한다.
보다 직접적인 결합특성 연구를 위하여 HBx의 정제를 시도하였다. Inclusion body로 형성된 His-tag HBx를 Ni-NTA 컬럼을 이용해 정제한 후 리폴딩을 시도하였다. pH 7 부근에서 리폴딩은 그 과정에서 aggregation이 발생하는 문제가 있었고, 낮은 pH에서의 리폴딩은 단백질의 용해성 문제는 해결하였으나, 활성이 없는 것으로 드러났다. GST 및 thioredoxin 중합 단백질은 마찬가지로 inclusion body가 형성되었지만, MBP-X는 용해된 상태로 존재하였다. 그러나, MBP-X를 thrombin으로 처리해보았더니 잘려진 X 단백질이 multimeric 형태로 존재하였으며, XIP에 대한 결합 활성도 없었다. 빛산란 실험을 통해 살펴본 결과 MBP-X는 용해되어 있지만 aggregation되어 있는 형태로 존재하였다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 산화환경에서 리폴딩을 시도하였다. 그 결과 monomeric 형태로 존재하는 MBP-X를 만들어낼 수 있었으며, 이에 thrombin을 처리해 보니 monomer 혹은 dimer의 X 단백질이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 여전히 XIP와의 결합 활성은 증명되지 않았다.
테네신 3는 테네브리오 몰리터 곤충에서 발견된 항진균성 단백질로 칸디다균의 성장을 억제할 수 있는 성질을 지녔다. 그러나, 이러한 항진균 메커니즘에 대해서 알려진 바가 없으므로, 이를 위한 선결 과제로 이 단백질의 물리적, 구조적 특질들을 연구하였다. CD 및 NMR 실험결과 이 단백질은 turn과 유사한 구조가 다량 존재하는 random coil으로 대부분 구성되어 있었으며, 온도, pH, 유기성 용매나 SDS와 같은 detergent들에 의해 구조적인 변화가 없었다. 하지만, GPC 실험 결과 random coil의 특성을 지녔음에도 불구하고 globular protein에 해당하는 hydrodynamic 특성을 가진 것으로 드러났다.
