Alkylpyridines are toxic environmental pollutants commonly found in many surface- and groundwater near industries for the production of synthetic liquid fuels. In this study, alkylpyridines degrading bacteria were isolated from an industrial wastewater by enrichment culture technique and their taxonomic and degradation characteristics were investigated.
One of the isolates, strain M43 degraded 4-methylpyridine (4-MP) and 4-ethylpyridine (4-EP) aerobically. Morphology, cellular fatty acid composition and sequence analysis of the 16s rDNA indicate that the bacterium is a member of the genus Pseudonocardia. The highest binary sequence similarity of 99.1 % was found with Pseudonocardia sulfidoxydans. The strain M43 was a filamentous bacterium and grew as pellicles in the liquid culture. During the course of 4-MP and 4-EP degradation, UV absorbing metabolites were transiently accumulated in the culture media. The metabolites produced from both 4-MP and 4-EP showed UV absorption maxima at 224 and 289 nm that are characteristic of 2-hydroxylated pyridines. The metabolite from 4-methylpyridine was identified to be 2-hydroxy-4-methylpyridine by mass spectral analysis. The strain M43 was able to use 2-hydroxy-4-methylpyridine as growth substrate. The results indicate that Pseudonocardia sp. strain M43 degraded 4-MP and 4-EP via initial hydroxylation to 2-hydroxy-4-methylpyridine and 2-hydroxy-4-ethylpyridine respectively. Beside of 4-MP and 4-EP, M43 also degraded pyridine among various pyridine derivatives. However, inability of M43 to use hydroxypyridines suggests that pyridine degradation pathway of M43 maybe different from the 4-MP and 4-EP degradation pathway. This is the first report on the hydroxylated intermediates produced during the degradation of 4-MP and 4-EP by pure culture.
Another isolate, strain LE31 degraded 3-ethylpyridine and 3-methylpyridine The strain LE31 was taxonomically studied by polyphasic approach. Strain LE31 was identified as a member of the genus Gordonia on the basis of ehemotaxonomic characteristics and 16S rDNA sequence analysis. Cell wall contained meso-diaminopimelic acid, arabinose and galactose (Wall chemotype IV). The predominant menaquinone is MK-9(H2). Mycolic acids contain 47 to 55 carbon atoms. The major fatty acids were C MO, C18:1 o.)9c, 10-methyl-C18:0 (TBSA). The G+C content of DNA was 67 mol%. The I 6S rDNA sequence was most similar to the 16S rDNA sequence of the type strain of Gordonia rubropertincta. The difference in some phenotypic characteristics and genetic distinctiveness distinguish strain LE3l from Gordonia species described previously. Therefore, it is proposed that strain LE3 I should be placed in the genus Gordonia as a new species. The name Gordonia nitida, for strain LE31, is proposed. The type strain of the new species is strain LE31 (= KCTC 0605BP).
The strain LE3I was able to use 3-ethylpyridine (3-EP) and 3-methylpyridine (3-MP) as sole source of carbon, nitrogen and energy. 3-EP supported considerably higher growth and required less time for degradation than 3-MP at the same concentration. Cells grown on 3-MP degraded 3-EP without lag time and vice versa indicating that degradation of 3-EP and 3-MP proceeds via same pathway. Although aromatic intermediates were not detected, formic acid was identified as a metabolite during the degradation of 3-EP and 3-MP. When cells were grown with 3-MP and 3-EP, activities for the metabolism of levulinic acid were induced. Formamidase and levulinic aldehyde dehydrogenase activity was higher with cells grown on 3-MP and 3-EP than that of cells grown on acetate. Taken together, degradation of 3-MP and 3-EP by Gordonia nitida LE3 I may proceed via a new pathway involving ring cleavage between carbons 2 and 3.
알킬피리딘은 화석 원료로 부터 합성 액상 연료를 생산하는 공장 근처의 지하수 및 지표수에서 많이 발견되는 독성 환경오염물질의 일종이다. 본 연구에서는 산업폐수에서 알킬피리딘을 분해하는 미생물을 분리하고 분리 균주들의 분류학적 특성 및 알킬피리딘의 분해 특성을 알아보았다.
분리된 균들 중 M43 균주는 4-메틸피리딘과 4-에틸피리딘을 호기적 조건에서 분해하였다. 형태학적, 지방산조성 및 16S rDNA 염기서열분석에 의하여 이 균주는 Pseudonocardia 속에 속하는 것으로 밝혀졌다. 이 균주와 분류학적으로 가장 높은 근연성을 가지는 균주는 Pseudonocardia sulfidoxydans였으며 99.1%의 유사성을 보였다. M43균주는 광학현미경 상에서 사상균의 형태를 보였으며 액체 배양 시에 응집된 입자 형태의 성장을 나타내었다. 4-메틸피리딘과 4-에틸피리딘의 분해 시 자외선을 흡수하는 중간 대사물이 배지 내에 일시적으로 축적되는 것이 관찰되었다. 생산된 중간 대사물은 2번 탄소에 수산기를 가지는 피리딘 화합물에서 일반적으로 보이는 224 및 289 nm두 파장에서 최대 흡광도를 보이는 흡수대를 나타내었다 4-메틸피리딘에서 생산된 중간산물은 앞의 결과와 mass spectra 분석에 의해 2-hydroxy-4-methylpyridine으로 밝혀졌다. M43 균주는 2-hydroxy-4-methylpyridine을 성장기질로 쉽게 이용할 수 있었다. 결과를 종합하면 새로 분리된 Pseudonocardia sp. M43 균주는 4-메틸피리딘과 4-에틸피리딘을 초기 수산화 과정에 의해 각각 2-hydroxy-4-methylpyridine 과 2-hydroxy-4-ethylpyridine으로 전환한 다음 대사하는 것으로 여겨진다. M43균주는 여러 피리딘 유도체들 중에서 4-메틸피리딘과 4-에틸피리딘 이외에도 피리딘을 분해하는 능력을 가지고 있었다.그러나 M43균주는 수산화 기를 가지는 피리딘 유도체들 중 아무것도 분해하지 못하였다. 따라서, M43 균주에 의한 피리딘의 분해는 4-메틸피리딘과 4-에틸피리딘 분해에 사용되는 경로와는 다른 경로를 거칠 가능성이 높다. 본 연구는 순수 분리된 미생물에 의한 4-메틸피리딘과 4-에틸피리딘의 분해 시 생성되는 수산화 중간대사 산물에 관한 연구로는 처음이다.
다른 분리 균주인 LE31 균주는 3-에틸피리딘과 3-메틸피리딘을 분해하였다. LE31 균주를 polyphasic 접근방법으로 분류하였다. LE31 균주는 화학분류적 특성과 16S rDNA 서열 분석을 바탕으로 Gordonia 속에 속하는 것으로 동정하였다. 세포벽의 조성으로는 meso-diaminopimelic acid, arabinose 및 galactose를 가졌으며 Wall chemotype IV로 분류되었다. 주요 menaquinone은 $MK-9(H_2)$ 였으며 세포벽의 mycolic acids는 47 - 55 개의 탄소를 함유하는 것들이었다. 세포막의 주요 지방산으로는 $C_{16:0}$, $C_{18:1}$ ω9c, $10-methyl-C_{18:0}$ (TBSA)를 포함하였으며 DNA의 G+C 함량은 67 mol%였다. 16S rDNA 염기서열 분석 결과 LE31균주는 분류학적으로 Gordonia rubropertincta와 가장 유사성이 높았다. LE31균주는 몇몇 표현형과 유전형의 특성이 지금까지 알려진 다른 Gordonia 균주와 틀리는 점을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 LE31 균주는 Gordonia 속 내의 새로운 종으로 보여지며 Gordonia nitida가 LE31균주의 이름으로 제안되었다. 새로운 종의 대표균주는 LE31 이다(= KCTC 0605BP).
LE31 균주는 3-에틸피리딘과 3-메틸피리딘을 단일 탄소원, 질소원 및 에너지원으로 사용할 수 있었다. 3-에틸피리딘을 성장기질로 공급했을 때는 3-메틸피리딘에 비해 균체의 성장이 많았으며 3-메틸피리딘 공급시 보다 짧은 시간에 분해가 이루어졌다. 3-메틸피리딘에서 성장한 세포는 3-에틸피리딘을 지연시간 없이 분해하였으며 3-에틸피리딘에서 성장한 세포도 3-메틸피리딘을 지연시간 없이 분해하였으므로 3-에틸피리딘과 3-메틸피리딘은 동일한 대사경로에 의해 분해되는 것으로 여겨진다. 방향족 중간대사산물은 검출되지 않았으며 포름산이 3-에틸피리딘과 3-메틸피리딘의 분해시의 중간 대사물로 확인되었다. 3-메틸피리딘 및 3-에틸피리딘에서 성장한 세포는 levulinic acid의 분해 대사가 유도되는 것을 알 수 있었다. 확인된 여러 효소들의 활성 중 formamidase와 levulinic aldehyde dehydrogenase의 활성은 acetate에서 성장한 세포에 비해 3-메틸피리딘 및 3-에틸피리딘에서 성장한 세포에서 높게 나타났다. 결과를 종합하면 Gordonia nitida LE31에 의한 3-에틸피리딘과 3-메틸피리딘의 분해는 피리딘 고리의 탄소 2번과 3번 사이의 결합이 분해되면서 진행되는 지금까지 알려지지 않은 새로운 대사경로를 따르는 것으로 보여진다.
