The papillomavirus E2 protein binds as a dimer to its cognate sequence $(ACCN_6GGT)$ and is involved in viral transcription and DNA replication. Analysis of the amino acid sequences of various E2 proteins shows that E2 shares well-conserved domains, such as the amino-terminus of the transactivation domain and the carboxy terminus of the DNA binding domain. The transcriptional activation function of E2 is important for its regulation of host cell cycle, as well as for the regulation of viral gene transcription and DNA replication. It has previously shown that E2 interacts with several host factors which is involved in transcriptional regulation, including basic transcription factors and co-activators such as AMF-1/Gps2, p300, and CBP to exert its function as transcriptional activator.
BRCA1 was first identified as a breast and ovarian cancer-related tumor suppressor and has been studied intensively for its role in damaged DNA repair and double-srand break-induced recombination. However, a growing body of evidence points toward a function of BRCA1 in transcriptional regulation in recent years. Two viewpoints regarding the function of BRCA1 have emerged. When tethered to a transcriptional promoter via a heterologous DNA binding domain, the C-terminal 304 amino acid region (residues 1560-1863) including the BRCT repeats can act as a trans-activation domain. It has been also reported that, when over-expressed in mammalian cells, the full-length BRCA1 protein can potentiate transcription from several natural promoters in a p53-dependent manner. In recent studies it was demonstrated that BRCA1 can interact with transcriptional activator p53 and ATF1 and act as a transcriptional co-activator, which is significant for the regulation of cell cycle or cell death by p53. To examine that there was some functional interaction between BRCA1 and E2, we performed the transient transcription assay. We show here that BRCA1 enhances human papillomavirus type 18 (HPV-18) E2-dependent transcription in C33A cells. Using biochemical approaches, we discovered that BRCA1 interacts with the carboxyl-terminus of HPV-18 E2 protein in vivo and in vitro and that the regions which are sufficient to interact with E2 map to amino acids 554-756 and amino acids 1560-1863 of BRCA1. The significance of the interaction regions was confirmed by constructing dominant-negative mutant of BRCA1. Overexpression of the dominant-negative mutant abolished the stimulation of E2-dependent transcription by BRCA1. The result implies that the mutant might break the bond between E2 and BRCA1, thus resulting in the failure of the transcriptional activation, and that BRCA1 has to associate with E2 in order to influence E2-dependent transcription. The association of BRCA1 with E2 and the targetting of BRCA1 to E2 binding site on promoter region was shown by chromatin immunoprecipitation assay. Using ChIP assay, we demonstrated that E2 binds to E2BS in vivo, and further we demonstrated that BRCA1 is recruited onto the E2-dependent promoter region though E2 tethered to E2 binding sites in vivo. Four different mutants with alterations in the C-terminus of BRCA1, which were derived from the breast and ovarian cancer, showed the defectiveness in the transcriptional activation of E2-dependent transcription. This finding suggests that the intact C-terminus of BRCA1 is important for E2-dependent transcription and that there is biological relevance of the interaction between BRCA1 and E2. Next, by GST pull down assay and transient transcriptional assay, we showed that BRCA1(1560-1863) also can associate with E2 and stimulate E2-dependent transcription. Finally, we showed that E2 activates the transcription from p21-promoter, and BRCA1 even stimulates it in a E2-dependent manner. These results implicate that BRCA1 plays a role in E2-dependent transcription as a coactivator and that BRCA1 has a influence in viral transcription, DNA replication, and/or the regulating the repression of cell growth, which are dependent on the function of transactivation by E2.
파필로마바이러스 E2 단백질은 특정한 DNA 염기서열 $(ACCN_6GGT)$ 에 결합능이 있으며 바이러스의 전사와 DNA 복제에 관여한다. 여러 타입의 파필로마바이러스로부터의 E2 단백질들의 아미노산 서열의 분석결과 E2는 아미노 말단의 전사활성 도메인과 카복시 말단의 DNA 결합 도메인의 잘 보존된 도메인을 가지고 있다는 것을 알 수 있다. E2의 전사활성 기능은 E2가 바이러스의 유전자 전사와 DNA 복제의 조절을 하는 데 뿐만 아니라 숙주세포의 세포주기를 조절하는 데에도 중요하다. E2는 전사조절에 관여하는 숙주 단백질인 주요전사인자들과 AMF-1/Gps2, p300, CBP와 같은 보조전사활성인자와 상호결합한다고 알려져 있다.
BRCA1은 처음에는 유방암과 난소암에 관련된 암억제인자로서 발견돠었고 손상된 DNA의 복구와 이중가닥 절단에 의해 유발되는 재조합에서의 역할에 대해 많은 연구가 되어 왔다. 그러나, 최근에 와서는 BRCA1이 전사조절에 관여한다는 증거가 늘어남에 따라 이 기능에 대한 연구에 초점이 맞추어지고 있다. 카복시 말단의 BRCT 도메인을 포함하는 304개(아미노산 1560-1863)의 아미노산을 이종 DNA 결합 도메인에 연결하였을 때 전사활성 도메인으로 작용할 수 있다. 또한 동물세포에서 과발현 되었을 때 BRCA1 단백질은 몇 개의 natural promoter로부터 전사를 촉진한다. 최근의 연구에 의하면 BRCA1이 전사활성 인자인 p53, ATF-1과 상호작용하여 보조전사활성인자로서 작용하며, 이것은 p53에 의한 세포주기 조절과 세포사멸 조절에 매우 중요하다.
우리는 BRCA1과 E2사이에 어떠한 기능적 상호작용이 있는지 조사하기 위하여 일시적 전사 분석법을 수행하였다. 그 결과 BRCA1은 C33A 세포에서 HPV-18의 E2 의존적 전사를 증가시키며, 이 것은 저위험군인 HPV-6b, 11 그리고 HPV-18과 같은 고위험군 바이러스인 HPV-16의 E2에 대해서도 같은 결과를 나타내었다. 또한 BRCA1에 의한 전사증가는 E2와 상호작용한다고 알려진 보조전사활성인자인 CBP와 협력하여 상승작용을 보인다. 이 사실로 미루어 BRCA1과 E2가 상호작용할 것이라고 예상되었고 생화학적 실험방법을 이용하여 생체 내에서 특이적으로 결합하는 것을 확인하였으며 그 결합위치도 결정하였다. 상호작용 부위의 중요도는 BRCA1의 dominant-negative 돌연변이를 제작하여 과발현하였을 때 BRCA1에 의한 E2의존적 전사의 증가를 억제하는 실험으로 증명되었다. 이 결과로부터 dominant-negative 돌연변이가 E2와 BRCA1 사이의 결합을 저해함으로써 전사활성을 억제하는 것을 추측할 수 있다. 또한 BRCA1이 E2의존적 전사에 영향을 주기 위해서는 E2와 결합해야 한다는 것을 암시한다. BRCA1과 E2의 결합, 그리고 promoter 부위의 E2-결합위치로 BRCA1이 이동되는 것은 염색질 면역침전 분석법 (ChIP assay) 을 이용하여 밝혔다. 이 실험의 결과에 따르면 생체내에서 E2는 E2-결합위치에 결합하고 BRCA1은 E2와의 결합을 통하여 E2-결합위치를 포함한 promoter부위로 이동된다. 유방암 또는 난소암조직으로부터 유래된 카복시 말단에 변이가 있는 돌연변이 BRCA1은 E2 의존적 전사를 증가시키지 못하였으며 이 결과는 E2 의존적 전사에는 온전한 BRCA1의 카복시 말단이 중요하며 BRCA1과 E2의 결합은 생물학적 의미가 있음을 시사한다. 다음으로는 GST pull down assay를 통하여 BRCA1(1560-1863) 또한 E2와 결합하여 E2 의존적 전사를 촉진할 수 있다는 사실을 밝혔다. 마지막으로 E2는 p21 promoter에 대해서 전사촉진을 하며 BRCA1은 이것을 더욱 증가시킨다는 것을 알게 되었다. 이러한 결과들에 의하여 E2 의존성 전사에 있어서 BRCA1은 보조전사활성인자로서 작용하며, E2의 전사활성 기능에 의존하는 바이러스 전사조절이나 DNA복제, 또는 숙주세포에 대한 조절기작에 대하여 영향을 줄 수도 있다는 것을 유추할 수 있다.
