The process for poly (γ-glutamic acid) (γ-PGA) production by Bacillus licheniformis ATCC 9945A was developed from fermentation to separation and purification. The productivity of γ-PGA fermentation can be increased dramatically by the efficient feeding strategy. That is, the glucose was fed to culture medium, which consists of glycerol, citric acid, and glutamic acid, with keeping the glucose concentration in broth 1 - 5 g/L. There was no catabolic repression due to the glucose feeding. The glucose feeding enhanced the consumption of other carbon sources such as glycerol, citric acid, glutamic acid, finally resulted in the high productivity and high concentration of γ-PGA. The glucose feeding also changed the way of γ-PGA production of cell. The γ-PGA was produced only by growth-associated way in medium E, but its production was continued glucose after the cell entered stationary phase when the glucose was supplied to culture medium. The other carbohydrates such as fructose, sucrose, and maltose also showed similar results. But the concentration of carbohydrates in culture broth should be lower than 20 g/L for avoiding the formation of polysaccharides. The productivity and concentration of γ-PGA was finally obtained 57 g/L and 3.1 g/L/h, respectively with fed-batch culture with glucose under 5 L fermentor.
For the mass production of γ-PGA, the scale-up of bioreactor was required. The scale-up of γ-PGA fermentation was not easy because of the high culture viscosity, which could lead the incomplete mixing of nutrient and low mass transfer coefficient. The incomplete mixing could cause the formation of the high glucose concentration region in fed-batch culture with glucose. This stimulates the production of by-products such as polysaccharides. Therefore, the efficient mixing was required for the successful scale-up of γ-PGA fermentation process. The mixing in γ-PGA fermentation was governed by the γ-PGA concentration in broth, thus the γ-PGA solution was used as model solution in mixing study. The mixing in bioreactor filled with γ-PGA was predicted computationally with commercial software package CFX 4.3 and was validated experimentally. The flow pattern in bioreactor was analyzed in both single (liquid) and two (liquid and gas)- phase for each. The mixing efficiency was affected severely by the impeller clearance in single- and two-phase system. In single-phase system the mixing efficiency in bioreactor decreased with impeller clearance. This might be due to the formation of separate cores of flow circulation by each impeller. The separation of core of flow circulation will decrease the mass transfer efficiency between cores of flow circulation. In single-phase system the best mixing was obtained at 0.2 D of impeller clearance. While the mixing efficiency increased with impeller clearance under two-phase system. Theses results contradict that of single-phase. The phenomenon can be explained by the role of air bubble in two-phase flow. The separate core of flow circulation formed in big impeller clearance was distorted, finally merged into one by the rising air bubble. The best mixing of gas and liquid was observed 0.8 D of impeller clearance in two-phase system. The optimal impeller clearance predicted by simulation showed a good agreement with that by experiment in both single- and two-phase system. Actually, the γ-PGA fermentation process is aerobic process. Thus, the impeller clearance should be adjusted to 0.8 - 1.0 D for the efficient mixing of gas and liquid.
The separation of γ-PGA from highly viscous culture broth could be done by centrifugation and batch settling with proper treatment of culture broth. The culture viscosity was one of the most important factors affecting γ-PGA separation efficiency. The acidification of culture broth resulted in the dramatic decrease of culture viscosity, and reduced the centrifugation time remarkably. The acidification of culture broth also induced the cell aggregation, and the aggregated cells were started to settle down. This made the γ-PGA separation by batch settling possible. The cell-free culture broth containing γ-PGA could be concentrated successfully with ultrafiltration membrane. The membrane with MWCO of 100,000 was employed in the γ-PGA concentration process because it showed a good rejection of γ-PGA as well as reliable flux. The γ-PGA solution could be concentrated up to 80 g/L without concentration polarization under pH 2 while the flux was not much changed from 35 LMH in the range of 30 - 80 g/L. When the pH of γ-PGA solution was 6, the flux was dramatically reduced with γ-PGA concentration and it reached almost 0 at 80 g/L. The loss of γ-PGA at pH 2 was 3.5% while 2% at pH 6. Therefore, it is more advantageous to lower pH in concentration process of γ-PGA solution considering the overall process efficiency. The purification of γ-PGA was done by discontinuous diafiltration (DD) and continuous diafiltration (CD). When the 80 g/L of γ-PGA solution that contains 2.5 g/L of total proteins and 60 g/L of glycerol as medium component was washed with 4 volumes of buffer solution by DD at pH 2, the proteins and glycerol was removed up to 93% and 95%, respectively. While CD with same volumes of buffer under same condition, the removal efficiencies of proteins and glycerol were 95% and 98%, respectively. The time average flux for DD and CD was 35 and 28 LMH for each. The γ-PGA could be recovered with alcohol precipitation. Among methanol, ethanol, 1-propanol, and 2-propanol, the highest γ-PGA recovery yield was obtained by 1-propraonl. The γ-PGA recovery yield with precipitation was affected by pH as well as kinds of solvent. The γ-PGA recovery yield was reduced as the pH of γ-PGA solution decreases below 6. This might be the reduction of γ-PGA at low pH because the reduced γ-PGA would be more soluble in the mixture of water and organic solvent than ionized γ-PGA.
미생물에 의해 생산되는 poly (γ-glutamic acid) (γ-PGA)는 생분해성, 생체적합성, 수용성 고분자로서 식품, 화장품 산업에서 활발히 응용되고 있으며, 의료분야에서도 약물전달 물질 혹은 봉합제 등으로 연구가 되고 있는 물질이다. 이밖에도 코팅재료, 압전소자, 폐수처리, 직물가공 등 광범위한 분야에 용용될 수 있지만, 생산단가가 비싸기 때문에 그 사용범위가 제한된다. 생산비를 낮추기 위해서는 높은 생산성, 스케일-업을 통한 대량 생산 그리고 효율적인 분리정제 기술이 필수적이다. 본 연구에서는 g-PGA 경제적으로 생산하기 위한 제반 생산공정을 다루었다. 즉, γ-PGA의 생산성을 높이기 위하여 효과적인 발효방법의 개발과 스케일-업시에 필요한 반응기 내의 유동분석 및 기체와 액체의 혼합현상 해석, 그리고 고점성 발효액으로부터 γ-PGA를 효과적으로 분리 및 정제하는 방법에 대한 연구를 수행하였다.
먼저, γ-PGA 생산성을 향상 시키기 위해 배지 성분의 최적화를 수행하였다. 시트르산, 글루탐산 및 글리세롤을 포함한 E 배지에 포도당, 설탕, 과당 등의 당류를 첨가함으로써 γ-PGA 생산성이 향상 되는 것을 관찰할 수 있었다. 허지만, 당의 첨가 농도가 20 g/L 이상일 때는 첨가된 당의 종류와 관계없이 다당류와 같은 불순물이 검출되었다. 다당류의 부산물을 억제하면서 당의 첨가효과를 최대화하기 위하여 유가식 배양을 수행하였다. E 배지에서 회분식 배양을 수행한 수, 배양액의 균체농도가 0.38 g/L(건조중량)이 이르렀을 때부터 포도당 용액을 배양액으로 공급하였다. 이 때 배양액의 포도당 농도는 5 g/L를 넘지 않게 한다. 이 방법을 통해 57 g/L의 γ-PGA와 3.1 g/L/h의 생산성을 얻을 수 있었다. 이는 기존의 생산성(0.3 - 1.0 g/L/h)을 획기적으로 높인 것이다.
생산비의 절감을 위해서는 생산성의 증대와 더불어 대량 생산이 가능해야 한다. γ-PGA 발효공정의 경우, 발효액의 높은 점성 때문에 대량생산을 위한 스케일-업이 쉽지가 않다. 더욱이, 앞에서 언급한 포도당을 비롯한 당을 이용한 유가식 배양 방법을 대용량의 발효조에 적용할 경우, 많은 문제점이 있을 수 있다. 대용량의 발효조의 경우, 발효액의 높은 점성으로 인해 불균일한 혼합이 일어나기 쉽고, 이는 당을 이용한 유가식 배양에서 국부적으로 높은 당의 농도를 유발시켜 다당류와 같은 부산물의 생성을 자극한다. 다당류는 γ-PGA의 정제공정에서 쉽게 제거되지 않기 때문에 결국 고순도의 γ-PGA를 얻을 수 없게 한다. 또한 발효액의 높은 점성은 발효조의 산소전달능력을 떨어뜨리므로 균체의 생장에 장애를 줄 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 γ-PGA 발효에서 발생할 수 있는 발효조 내의 유동을 해석하고, 이를 실험적으로 검증하였다. γ-PGA 발효액의 유변학적인 특성은 발효액의 g-PGA 농도에 의존하므로, 모든 실험은 γ-PGA 용액에서 수행하였다. 발효조 내의 유동해석은 단상(액상)과 이상(액상과 기상) 각각에 대하여 행하여졌으며, 사용된 코드는 CFX 4.3이다. 단상과 이상 각각에서 두 임펠러의 간격은 혼합에 많은 영향를 끼쳤으며, 단상의 경우는 두 임펠러의 간격이 좁을수록, 이상의 경우에는 간격이 클수록 좋은 혼합효율을 나타내었다. 이런 모순된 현상은 다음과 같이 해석될 수 있다. 단상의 경우 액상의 점성이 높을 때, 임펠러의 간격이 커면 각각의 임펠러에 의해 생성된 flow는 서로 어느 정도의 독립성을 가지게 되는데, 이는 발효조 내의 전체 혼합을 비효율적으로 만든다. 반면에 좁은 임펠러 간격은 각각 임펠러에 의한 flow가 서로 중첩이 되어 마치 하나의 큰 임펠러에 의한 flow를 형성하게 되어 발효조의 내의 전체적인 혼합을 효율적으로 만든다. 이상의 경우에는 좁은 임펠러 간격은 발효조의 아랫부분의 혼합을 좋게 함지만, 임펠러에서 멀리 떨어진 윗쪽 부분은 혼합이 좋지 않다. 반면에 임펠러 간격이 커지면서 혼합효율이 상승하는 이유는 단상에서 보였던 각각의 임펠러에 의한 독립된 flow가 발효조 밑부분에서 공급되는 공기 방울에 의해서 쉽게 부서지면서 원활한 혼합을 가져오기 때문이다. 이는 전산모사를 통해서 예측이 되었고, 실험으로서 증명이 되었다. γ-PGA 발효의 경우, 기상과 액상의 혼합이 중요시 되므로, 발효조 내의 원활한 혼합을 위해서는 두 임펠러의 간격은 0.8 - 1.0 D정도가 적당함을 알 수 있었다.
마지막으로 효율적인 γ-PGA 분리 역시 생산비 절감에 중요한 요소이다. 기존의 원심분리방법은 발효액의 높은 점성 때문에 높은 원심력과 긴 원심분리 시간을 요구하였다. 발효조의 대형화에 따른 대용량의 발효액에서부터 γ-PGA 신속하게 처리하기 위해서는 새로운 방법이 필요하다. 본 연구에서 발효액의 pH를 조절하는 간단한 방법을 통하여 발효액으로부터 g-PGA를 효과적으로 분리할 수 있었다. 즉, 발효액의 pH를 2-3로 낮춤으로 발효액의 점도를 획기적으로 줄일 수 있었다. 이는 γ-PGA가 환원됨 따라 전하를 잃어버림에 기인한다. 발효액의 pH 강하는 점도의 감소뿐만아니라 균체의 응집을 유도하였다. 이는 균체싸고 있는 γ-PGA capsule층이 전하를 잃으면서 잃어난 현상이다. 점성의 강하와 균체의 응집은 배양액으로부터 γ-PGA와 균체를 분리하는 시간을 크게 줄일 수 있었다. 뿐만 아니라, 응집된 균체는 다른 공정없이 자연적으로 침강되기도 하였다. 균체가 제거된 폴리글루탐산 용액은 배제분자량이 100 kDa인 한외여과막을 이용하여 농축하였다. 농축공정은 고농도의 폴리글루탐산을 얻는 동시에 저분자량의 분순물 (배지성분 및 기타 단백질)을 제거할 수 있다. 이 공정에서도 γ-PGA 용액의 pH 조절은 중요한 역할을 하였다. 즉, pH를 2로 낮춤으로 평균 flux를 35 LMH 정도로 유지하면서 30 - 40 g/L의 γ-PGA 용액을 80 g/L까지 농축할 수 있었다. 농축공정은 용액의 부피를 감소시킴과 동시에 높은 농도의 γ-PGA 용액을 얻을 수 있게 하므로, 알코올 및 유기용매로 γ-PGA를 회수할 때, 용기용매의 양을 크게 줄일 수 있다. 이는 전제 분리공정의 비용을 감소를 유도함으로써 결국 γ-PGA 생산비를 낮게 한다.
