Chromosomal DNA replication is a key step not only for genetic inheritance but also for the regulation of cell proliferation. Intensive biochemical studies revealed the role of initiator proteins in DNA replication. But, the molecular mechanisms underlying the regulation of initiation process is relatively unexplored.
For identifying the genes involved in that regulation, DDRT-PCR was adapted. It was designed to detect the alternation of transcript during cell cycle, but prevailing method was not efficient for prokaryotic RNA. So the first aim of my study is to develop DDRT-PCR for sensitive analysis. This purpose was accomplished by modulating the polyadenylation step; In that step, trans-acting DNA primer restricted the poly(a) tail-length and recruit the poly(A) polymerase to unreacted RNA substrate in first cycle.
Next, an effort to find a noble DNA binding protein was suggested as being important to gain a better insight in this regulation process. So, novel candidates were implied to have DNA binding ability. The second aim of my study is characterization of putative DNA binding protein. In this study, the B1625 protein, one of the candidates, was purified in the Thioredoxin(Trx)fusion form and its oriC specific binding properties were confirmed.
RNA의 발현 양상을 연구하기 위해서는 DDRT-PCR이 주로 이용된다. 그러나 기존의 방법은 bacterial system에 그대로 적용될 수는 없었고, 그 sensitivity 또한 낮았다. 그래서 이번 연구의 첫번째 내용은 기존의 A-tailing 방법을 개량하는 것이었다. 그 원리는 polyadenylation 과정에 trans-acting DNA primer를 사용하는 것이었다. 이 경우 poly(A)-tail의 길이를 제한해줄 수 있었다. 그리고 이렇게 polyadenylation 과정을 조절함으로써 그렇지 않은 경우에 비해, DDTR-PCR의 sensitivity의 향상을 가져올 수 있었다. 이 기술은 세포주기 및 생장주기에 따라 다르게 나타나는 전사체를 관찰하여 대장균의 염색체 DNA 복제 조절에 관계하는 새로운 조절인자를 찾는데 적용될 것이다.
이번 연구의 두번째 내용은, bacteria의 복제개시 지점인 oriC 영역에 binding 하는 가상의 단백질의 특성을 규명하는 것이었다. 가상의 orf인 B1625는 그 기능은 물론이고 발현 여부조차 알려져 있지 않았다. 그러나 in vivo binding assay를 통해 DNA와의 결합가능성을 가진 후보로 지목되었다. 이번 실험을 통해서 먼저, B1625의 promoter들이 선별되었다. 그리고, Thioredoxin과 fusion된 형태로 정제되었다. 마지막으로 DNA와의 결합 능력이 확인되었으며 그것은 oriC와의 specific한 결합임을 밝혔다.
