XPC is considered to be the first protein to recognize damaged DNA in global genome nucletide excision repair and the activity is greatly stimulated by addition of hHR23B protein. From the domain study, residues from 277 to 332 were enough to stimulate XPC activity. Structural studies of XPC binding domain of hHR23B could identify the structural changes in XPC bound complex, thus explain the enhanced damage recognition activity upon complex formation. To address this question, the expression vector of XPC binding domain of hHR23B (277 332) was constructed, and the domain was purified. CD experiments of XPC binding domain of hHR23B showed that its secondary structure was mainly composed of alpha helical forms, and strong prediction was made that this helices contains amphipathic features. However, this helical, amphipathic XPC binding domain of hHR23B suffered from severe aggregation when it was concentrated for NMR studies, leading to broad, uninterpretable spectra. For structural studies using NMR spectroscopy, the optimization for the best soluble condition was urgently required. The proper detergent and its amount for high protein concentration without structural modification of the protein were screened using near and far UV CD spectra and NMR methods. The secondary structure of XPC binding domain of hHR23B was not sensitive to pH, salt, organic solvent such as methanol and trifluoroethanol, and various detergents, which includes sodium dodecyl sulfate, dodecyl phosphate choline and octylglucoside. The protein was effectively concentrated up to 0.6 mM in 15 % methanol, and over 1 mM in 40mM octyl glucoside. Although 40 mM octyl glucoside was the most effective solubilizer, some distinct changes of chemical shifts were observed in $^{15}N-HSQC$ spectrum.
But regarding to the near UV CD experiment, these chemical shift change may result from binding of octylglucoside to the protein and the structure being sustained. However, $^{15}N-HSQC$ spectra in the presence of 15 % methanol showed almost same tertiary structure as in the native state. In addition, the viscosity of protein solution with methanol was lower, leading to shorter correlation time, and longer $T_2$ with narrow linewidths. Therefore, optimal condition for high concentration for further study would be in the presence of 15% methanol.
XPC는 손상DNA를 인식하는데 있어 처음에 작용한다고 알려져 있다. 이러한 XPC 단백질과 complex를 이룸으로써 XPC가 처음에 인식하는 과정에서 그 activity를 높여주는 단백질이 hHR23B이다. HHR23B가 존재하면 XPC의 기능이 열 배 이상 향상된다고 알려져 있다. 인식 단백질인 XPC에 작용하는데 있어 전체 hHR23B가 아닌 아미노산 227에서 332까지만 잘라낸 작은 부분만으로도 XPC와 binding울 하여 XPC의 기능이 유지된다는 것이 알려져 있다. 이 hHR23B의 작은 부분은 어떠한 catalytic activity보다는 자체적으로 XPC에 binding함으로써 구조에 직접적인 변화를 주어 XPC를 stimulate한다고 생각되어진다. 그렇기 때문에 이 부분의 구조를 알아냄으로써 어떠한 형태로 XPC와 binding하여 XPC의 activity를 직접적으로 높이는지 알아보는 일이 무척 흥미로운 일이 될 것이다. 이러한 구조를 밝혀내기 위해 hHR23B full genome으로부터 227-332부분만을 클로닝하여 단백질을 발현시켜 분리 정제하였다. 그러나 단백질의 amphipathic성질로 인해 NMR구조분석을 위한 충분한 농도로 농축이 불가능하였다. 이 부분은 pH나 염에 민감하지 않기 때문에 detergent를 이용하여 농축하는 게 가장 효과적인 방법이었다. 그러나 구조연구를 위해서는 단백질이 이러한 detergent 존재 하에 원래의 구조를 유지하고 있는지 알아보는 것이 가장 중요했다.
여러 가지 detergent들로부터 가장 적당한 조건을 잡기 위해 1D NMR, $^{15}N HSQC$, near＆farUV CD 분광법들을 이용하여 본 결과, SDS, DPC는 구조를 심하게 변형시키는 것으로 나타났고, 나머지는 농축에 효과적이지 못했다. 용매를 승화시켜 lyophilization한 단백질도 사용할 수 없다는 것을 알았다. 가장 좋은 방법은 NAP25컬럼을 이용해 salt를 빼낸 후 적당한 detergent를 첨가하여 농축하는 것이었다. 그리고 이 때 사용할 적당한 detergent로는 2가지가 가능하다. 하나는 40mM octylglucoside를 이용하면 충분한 농도로 농축이 가능하지만 $^{15}N HSQC$의 결과로 이루어볼 때 3차 구조에는 변화를 주는걸로 보인다. Near UV CD를 찍은 결과, 3차 구조에는 별로 영향을 주지 않는걸로 나타났다. 또하나는 15% methanol로, 이를 사용하면 hHR23B의 구조가 원래의 형태에서 거의 변화가 없고 $T_2$가 길어져 스펙트럼이 훌륭하게 나온다는 장점이 있어 구조분석하기에 가장 좋지만 3D까지 찍을 수 있는 1mM까지는 농축을 하기가 어렵다는 문제점이 있다.
그러나 꼭 그 농도가 아니더라도 0.6-0.7mM정도로만 농축해도 구조를 분석할 수 있기 때문에 15% methanol 존재하에서 농축하는 게 지금으로서는 가장 효과적인 조건이 된다.
