The ubiqutin (Ub)-like domain of hHR23B is known to specifically interact with S5a, a subunit of 26S proteasome complex. Since hHR23B is one of necessary factor in DNA repair systems, such an interaction might play a role in the regulation of the DNA repair process. The structural studies of the ub-like domain of hHR23B using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was attempted in this study to delineate the specific interaction between the Ub-like domain of hHR23B and S5a.
Ub-like domain of hHR23B with a N-terminal six histidine tag overexpressed as a soluble form in E.coli. Binding assay confirmed the interaction between GST-S5a (residues of 263 to 342). Protein backbone resonances of $C^\alpha$, $C^\beta$, CO, $N^H$, and $H^N$ were fully assigned using several hetero-nuclear NMR spectroscopy ; CBCA(CO)NH, HNCACB, $1^H-{15}^N HSQC$, $1^H-{13}^C$ HSQC and HN(CO). Unlike the ubiquitin protein family, featuring the $\beta \beta \alpha \beta \beta \alpha \beta$ fold of ubiquitin, Ub-like domain of hHR23B has $\beta \beta \alpha \beta \alpha \beta \beta$. Furthermore, Ub-like domain in hHR23B has additional eight amino acids to ubiquitin at C-terminus. These characteristics seem to explain the cause that Ub-like domain of hHR23B has specific interaction to S5a.
유전자의 손상이 유전자 복제 및 세포 분할과정이 진행되기 전에 인식되어 그것을 회복하기 위한 시스템이 원활히 진행되는 것은 중요하다. 특히, ubiquitin는 26S proteasome과 결합하여 단백질들을 분해시키는 과정을 통해 세포 사이클을 조절하는 것으로 알려져 있다. hHR23B은 ubiquitin과 34% 의 상동성을 지닌ubiquitin 유사 도메인을 가지고 있으며, 이곳은 ubiquitin이 26S proteasome에multiubiquitin 되면서 결합하는 도메인과 부분적으로 겹치는 것으로 보고되었지만, hHR23B의 상세한 기능과 구조는 아직 밝혀져 있지 않다. hHR23B ubiquitin 유사 도메인에서 흥미로운 점은 ubiquitin 유사 도메인을 가지고 있는 다른 단백질들 또는 ubiquitin과는 다르게 S5a에 대해 높은 선택적 결합력을 가지고 있다는 것이다.
본 연구에서는 NMR spectoscopy를 통한 구조 분석으로써, hHR23B ubiquitin 유사도메인의 S5a에 대한 선택적 결합력의 존재를 확인하고자 했고, 이를 위해 다음과 같은 일련의 연구를 수행하였다.
먼저, hHR23B ubiquitin 유사도메인을 가지고 있는 유전자를 pET15b벡터에 클로닝하여 His- tagged fusion 단백질의 형태로 이를 대장균에서 대량으로 발현시켰다. 그 후, affinity 컬럼과 사이즈를 이용한 gel permeation컬럼을 이용하여 이를 정제하여 동위원소 탄소와 질소로 레이블 된 99%이상으로 순수한 단백질을 얻을 수 있었고, 이렇게 얻은 단백질을 함께 복합체를 이룬다고 밝혀진GST-s5a의 상호간 결합을 확인하기 위해 pull down assay를 시행하였고, SDS-PAGE로 확인한 결과 둘 사이의 결합의 존재를 in vitro에서 밝힐 수 있었다. 이렇게 확인된 hHR23B의 ubiquitin 도메인의 S5a에 대한 특이적 결합성에 대한 원인을 구조적인 관점에서 규명하고자 다양한 NMR 실험들을 수행하였다. 이로써, Backbone에 있는 알파, 베타 탄소와 아마이드 질소와 아마이드 수소, 그리고 카보닐을 assign을 위해 CBCA(CO)NH, HNCACB, $1^H-{15}^N HSQC$, $1^H-{13}^C$ HSQC, HNCO 스펙트럼을 각각 분석하였다. 이러한 과정을 통해 96.6%의 아미노산을 assign할 수가 있었으며, $\beta \beta \alpha \beta \alpha \beta \beta$ 라는 전형적인 ubiquitin의 2차구조를 가지고 있음을CSI 프로그램을 사용하여 확인할 수 있었다. 이 결과를 분석해 본건데 전제적으로는 ubiquitin fold를 가지고 있지만 부분적으로 $\beta 3$ 와 $\beta 4$ 사이에 $\alpha 2$ 가 있어서 $\beta 4$ 와 $\beta 5$ 사이에 $\alpha 2$ 가 있는 일반적인 ubiquitin또는 ubiquitin-like 도메인을 가진 단백질과는 구조에서 극명하게 차이가 나타나고 있다. 뿐만 아니라 C 터미날에 ubiquitin보다 8개 아미노산을 더 가지고 있으며 또한 3차구조 에서도 charge topology가 다르게 나타날 것으로 예상되고 있다. 이러한 모든 결과로써, hHR23B의 ubiquitin 유사 도메인은 ubiquitin과 부분적으로 나타나는 차이가 다른 ubiquitin-like 도메인을 가지고 있는 단백질에 대해서도 특이성을 나타낼 것이라고 여겨진다. 앞으로 3차원 구조 분석은 S5a에 대한 결합 특이성을 명확하게 규명할 수 있을 것이다.
