For confirming esterase from Pseudomonas putida 3SK was an autotransporter protein, esterase activity of the whole cell and the supernatant versus culture time, effects of trypsin treatment and cellular localization in Escherichia coil were determined. The esterase activity profile of the whole cell corresponded well with the cell growth curve and majority of esterase activity was detected in the whole cell, revealing that enzyme was not secreted. Trypsin treatment of whole cells released a significant amount of esterase, indicating that the enzyme was located in the outer membrane with the catalytic domain exposed to the surface. We revealed that the enzyme was associated with the cellular membranes by cellular localization. The catalytic activity of this bacterial surface displayed esterase was enhanced by evolutionary molecular engineering. Five mutant esterases were isolated after error-prone PCR performed to introduce random mutations and screening on a tributyrin agar plate. We determined that these mutant esterases had about 4 amino acid substitutions and these substitutions were concentrated on two specific parts of their whole amino acid sequences. The catalytic activity of wild-type and mutant enzymes was determined; Ml, M2, M3, M4 and M5 had 5.7-, 3.8-, 4.3-, 1.8- and 4.1-fold increased catalytic activity compared to their wild-type enzyme, respectively. Thus, we found the autotransporter protein is effective expression system that could improve properties of enzymes by applying evolutionary molecular engineering. This evolved autotransporter enzyme gives more opportunities for using as whole cell catalyst.
P. putida 3SK 유래의 esterase가 autotransporter protein으로 작용한다는 것을 확인하기 위하여 배양 시간에 따른 세포와 세포 밖의 esterase 활성, trypsin을 처리했을 때의 효과, 세포 소부분들 각각의 esterase 활성을 E. coli에서 살펴보았다. 전체 세포의 시간에 따른 esterase 활성의 증가는 세포의 성장 곡선과 아주 유사한 모양을 보여주었으며 esterase 활성의 대부분이 세포 부분에 있었는데, 이는 효소가 분비되지 않는다는 사실의 증거가 된다. 전체 세포에 trypsin을 처리했을 때, 어느 정도 esterase의 활성이 감소하는 결과를 보였는데 이것 역시 효소의 활성을 나타내는 부분이 세포 표면에 드러나 있다는 것을 뜻하며, 세포 소부분들의 esterase 활성을 측정한 결과 이 효소가 세포막에 위치하여 있다는 사실을 알 수 있었다. 이렇게 박테리아의 세포막 표면에 위치하고 있다고 확인한 esterase의 촉매 활성을 인위적 분자 진화 방법을 이용하여 증가시켰다. 임의의 돌연변이를 유발하기 위한 error-prone PCR과 tributyrin agar plate에서의 선별과정을 거친 후, 촉매활성이 증가한 5개의 esterase (M1, M2, M3, M4, M5) 를 분리하였다. 이들은 약 4개의 아미노산 치환을 가지고 있음이 밝혀졌는데, 이런 아미노산 치환은 전체 아미노산 서열 중에서 특정한 두 부분에 집중해있었다. Esterase와 그 변이효소 5개의 촉매활성을 살펴본 결과, M1, M2, M3, M4, M5는 원래 esterase에 비하여 각각 5.7, 3.8, 4.3, 1.8, 4.1배 더 높은 촉매활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 이렇듯, autotransporter system은 인위적 분자 진화 방법을 적용하여 효소의 특성을 개량할 수 있는 효과적인 발현 system임을 알 수 있었다. 이렇게 개량된 효소는 whole cell catalyst로서 더 많은 기회를 제공할 수 있다.
