Glutamine synthetase (GS; EC 6.3.1.2) catalyzes the ATP-dependent conversion of ammonia and glutamate to glutamine. It is one of the key enzymes in nitrogen metabolism, and primarily used for ammonia detoxification and glutamine biosynthesis. Besides its role in nitrogen metabolism, GS is also known to play an important role in neurotransmitter recycling, converting neurotransmitter glutamate to glutamine, thereby preventing possible neurotoxicity.
A GS genomic clone was obtained in Beagle genomic library screening. Genomic structure of GS was determined, showing seven exons and six introns as reported in other mammalians. In our study of canine GS gene, two forms of GS 5’ UTRs were found by 5’-cRACE. RT-PCR analysis and sequencing of the first intron revealed that these UTRs arose by the alternative splicing of the first intron. These two 5’ UTRs are exactly the same except that the longer 5’ UTR has a 120 bp insert in the middle. Sequence comparison of canine GS intron 1 with human GS intron 1 showed that human GS intron 1 has a similar 120bp-like insert, but RT-PCR analysis of human and mouse tissues showed that, contrary to dogs, they have only one form of 5’ UTR having no alternative splicing in intron 1.
Semi-quantitative RT-PCR showed that both of the two 5’ UTRs are expressed in 12 tissues(frontal lobe, parietal lobe, occipital lobe, thalamus, medulla oblongata, cerebellum, lung, liver, heart, skeletal muscle, kidney, spleen), but their ratios are different. To study the influence of two UTRs on translational efficiency, plasmids containing either of two UTRs with a firefly luciferase gene were constructed and transfected into 293T cells. The luciferase assay didn’t show a significant difference between them.
Glutamine synthetase는 ATP를 사용하여 암모니아와 글루타민산을 글루타민으로 바꿔주는 기능을 하며, 질소대사에서 핵심적인 역할을 하는 효소 중 하나이다. 생체 내에서는 주로 암모니아 탈독화와 아미노산 글루타민의 생합성에 관여하는데, 질소대사에서의 이런 역할 외에도 뇌에서의 신경전달물질의 재생사이클에서 신경전달물질인 글루타민산을 글루타민으로 바꿔줌으로 중대한 기능을 담당하는 것으로 알려져있다.
우리는 비글 genomic DNA library screening으로 개의 glutamine synthetase 유전자의 genomic structure가 현재까지 보고된 다른 포유동물에서처럼 7개의 엑손과 6개의 인트론으로 구성되어 있음을 밝혀내었다. 본 연구에서 개의 glutamine synthetase 유전자에는 두 종류의 5' UTR이 있음을 5' cRACE를 통해 발견하였으며, RT-PCR 분석과 첫번째 인트론의 염기서열분석을 통해 이 결과를 확인하고, 이 두 종류의 5' UTR이 첫번째 인트론의 alternative splicing을 통해 만들어진다는 것을 밝혔다. 인간의 glutamine synthetase 유전자의 첫번째 인트론의 염기서열과 개의 glutamine synthetase 유전자의 첫번째 인트론의 염기서열을 비교분석해보면, 개의 5' UTR에 있는 120 base pair 크기의 insert 서열과 유사한 서열이 인간의 첫번째 인트론에서도 발견된다. 그러나, 인간과 쥐(mouse)의 조직을 사용한 RT-PCR 분석결과는 이들에게서는 5' UTR 부위에 개와는 달리 alternative splicing이 없음을 보여주었다.
Semi-quantitative RT-PCR을 통해서 이 두 종류의 5' UTR이 조직마다 다른 비율로 전사된다는 것을 알아내었다. 그리고 이들이 단백질의 번역 효율에 어떤 영향을 주는지 알고자 하여 luciferase 유전자를 reporter로 하는 벡터를 조합하여 293T cell에 transfection하고 luciferase activity를 측정하여 보았다. 그러나, 이 실험에서는 두 종류의 5' UTR에서 유의미한 차이를 보이지 않았다.
