A mouse gene, mPer2, having all the properties expected of a circadian clock gene, was reported recently. This gene is expressed in a circadian pattern in the suprachiasmatic nucleus(SCN), the mammalian circadian center. The mPer2 maintains this pattern of circadian expression in the constant darkness and can be entrained to a new light/dark cycle. The mPer2 is assumed to be a key molecule in the regulation and functioning of the mammalian circadian clock, which is based on the oscillation generated by a transcription-(post) translation feedback loop of a set of clock genes. To investigate the mechanism underlying the complex regulation of mPer2 expression, we isolated and characterized the promoter region of the mPer2.
To gain insight into the regulation of the mPer2, we functionally analyzed 7,748-bp BamH I fragment (containing 1,158-bp 5' upstream region and 6,590-bp intron 1) and 3,280-bp Xba I fragment (containing 1,158-bp 5' upstream region and 2,122-bp intron 1) of the mPer2. These regions lack a TATA box, but has one E-box in the first intron. Transient transfection assays using a mPer2 promoter-luciferase reporter gene in human liver-derived HepG2 cell line revealed that potential negative regulatory element exists in the 4,468-bp intron 1. Transient transfection assays of progressively deleted fragments of the 4,468-bp region were used to identify two regions from +3082 to +3239 (NRI: negative regulation 1) and from +5743 to +5908 (NR2 : negative regulation 2) that contain putative negative regulatory elements. Binding affinities of DNA-protein interactions were defined by electrophoretic mobility shift assays and the protected nucleotide positions were determined by DNase I footprinting. Site-directed deletion mutagenesis of those protected regions revealed nucleotides at positions from +3165 to +3185 (NR1D2) and from +5795 to +5825 (NR2D1) as being necessary for negative control. EMSA and SDS-PAGE analysis using DNA sequences containing +3165 to +3185 region and +5795 to +5825 region respectively showed that nuclear factors specifically interacting with the +5795 to +5825 region (NR2D1) were composed of two polypeptides of 26 kDa and 32 kDa. N-terminal amino acid sequencing result of the 32 kDa polypeptide showed that myb-related protein is the best candidate for the NR2D1-binding repressive protein. The myb-related protein has been reported that it can bind specific DNA sequence(CfTAACG/TG, for most organism) that is closely related to the E-box hexanucleotide and regulate transcription. NR2D1-binding protein couldn't bind the oligonucleotide sequence containing mutated E-box (muNR2D1). Thus, NR2D 1-binding protein showed the E-box sequence specific binding manner. The more detailed characterization of the transacting factor(s) interacting with this key regulatory element will shed light on its role in regulating circadian expression of the mPer2.
생체 시계 조절에 관여하는 쥐 피어리어드 2 (mPer2) 유전자가 최근에 보고되었다. 이 유전자는 뇌의 시상하부에 위치하고 있는 포유류 생체 시계의 주 페이스 메이커인 교차상핵(SCN : suprachiasmatic nuclei) 에서 24시간을 주기로 리듬을 그리며 발현된다. 이 리듬은 일정한 어둠 속에서도 유지되며, 새로운 빛-어둠 주기로 다시 시작될 수 있다. 쥐 피어리어드 2 유전자는 쥐 생체시계의 조절과 기능에 중요한 역할을 할 것으로 예상되며, 이는 다른 생체시계 유전자들과 마찬가지로 전사-번역 음성 피드백에 의해 생성되는 스스로의 리듬에 의해서 일 것으로 예상된다.
쥐 피어리어드 2 유전자의 발현을 조절하는 메커니즘을 규명하기 위해 우리는 이 유전자의 조절부위 (promoter)를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과 다른 유전자 조절부위에서 볼 수 있는 TATA-box는 존재하지 않았으나, CLOCK-BMAL1 이 결합할 수 있는 하나의 E-box가 존재함을 발견하였다.
조절부위 내 순차적이면서도 연속적인 결손 부위를 만들어 luciferase activity를 측정하였다. 그 결과 조절부위 활성에 중요한 역할을 할 것으로 추측되는 첫번째 intron 지역에서 +2141~+3082 와 +5103~+5578 부위 내에 positive element 가 존재하며 +3082~+3554 와 +5578~+6073 부위 내에 negative element 가 존재함을 밝혀냈다. negative element에 초점을 맞추고 이 부위를 좁히기 위해 이 부위 내 추가적인 결손부위를 만들어 luciferase activity를 측정하였으며, 그 결과 +3082~+3239 와 +5743~+5908 부위 내에 negative element 가 존재함을 밝혀냈다.
이 부위에 특이적으로 결합하는 단백질이 존재함을 EMSA를 통해 알 수 있었고, DNaseⅠfootprinting 실험을 통하여 단백질의 결합에 의해 보호되는 sequence의 위치도 밝혀내었다. 이 보호된 sequence 들을 deletion 시켜 돌연변이로 만들어보았을 때, 두 sequence (+3165~+3185 와 +5795~+5825)가 조절부위의 활성에 가장 큰 영향을 미침을 확인하였다. 이들 sequence 상에는 AP-3, E-box, Pbx-1 등의 전자 조절에 관여하는 인자들의 결합 부위가 존재함을 computer database search를 통해 알 수 있었다. 이 두 sequence 중 한 sequence (+5795~+5825)에 특이적으로 결합하는 단백질이 존재함을 EMSA와 SDS-PAGE 실험에 의하여 밝혔으며, 그 크기는 26kDa 과 32kDa 정도였다. 32kDa의 단백질을 (N-terminal) amino acid sequencing한 결과 myb-related protein 이 매우 유력한 후보로 밝혀졌으며, 이 단백질은 E-box hexanucleotide와 밀접히 연관된 DNA sequence(C/TAACG/TG)에 붙어서 전사를 조절할 수 있는 것으로 보고된 바 있었다. 실제로 이 sequence 내에 있는 E-box를 돌연변이 시킨 DNA에는 이 단백질이 붙을 수 없었다. 이 조절 부위에 작용하는 인자를 찾아내어 보다 명확하게 규명하는 일은 쥐 피어리어드 2 유전자의 주기적 발현을 조절하는 기작을 이해하는 데 기여를 할 것이다.
