In vivo excision and amplification of pre-determined, large genomic segments, directly from the genome of a natural host could be a novel cloning method for gene therapy. In this study, an in vivo excision and amplification system for human cells was devised with the Cre/loxP system of bacteriophage P1 and the large T antigen/SV40 on system of Simian virus 40. Two loxP sequences, each of which serves as a recognition site for recombinase Cre, were integrated unidirectionally into the 51- and 3'-end regions of the CFTR gene. SV40 on sequence, which serves as a conditional replication system, was inserted between the loxP sequences. Trans-acting gene cre and large T antigen, each of which was under the control of a tetracycline responsive promoter, were also inserted into the 5'- and 3'-end regions of the CFTR gene, respectively, by homologous recombination. The human BJAB cell line carrying the inserted elements was stably maintained until the excision and amplification functions were triggered by the induction of cre and large T antigen. Upon induction by doxycycline, the 250-kb CFTR genomic region of human chromosome 7 flanked by two loxP sites was excised. Our method is very useful for obtaining large genomic fragments in quantities directly from a natural host without using foreign hosts.
Cystic fibrosis 관련 단일 유전자인, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene을 human cells에서 직접 분리하여 증폭할 수 있는지를 연구하였다. CFTR 유전자는 human chromosome 7에 위치한 약 250kb의 genomic fragment이다. CFTR genomic DNA를 분리하기 위하여 위치 특이적 재조합 효소계인 cre/loxP system을, 분리된 genomic fragment를 증폭시키기 위하여 바이러스의 복제 시스템인 large T antigen/SV40 ori system을, Cre와 large T antigen의 발현을 조절하기 위하여 Tet-On system을 사용하였다.
본 연구에서는 CFTR gene을 분리하기 위하여 Cre recombinase의 인식부위인 loxP sequence 두 개를 각각 CFTR gene의 5'-end, 3'-end부분에 삽입 시켰다. 이 때, cre gene, SV40 ori sequence는 loxP sequence와 함께 5'-end부분에, large T antigen gene, rtTA gene은 loxP sequence와 함께 3'-end에 삽입하였다. 이와 같이 분리증폭에 필요한 구성요소를 모두 갖춘 인간세포주인 BJAB-NC를 만든 후 이 세포주에서 Cre와 large T antigen을 Tet-On system으로 유도 발현 시킬 수 있음을 확인 하였다. 또한 유도 발현된 Cre가 CFTR 유전자를 절단할 수 있음을 확인 하였으며, 마찬 가지로 유도 발현된 large T antigen이 절단된 CFTR 유전자를 어느 정도 증폭 시켰는지는 분석 중에 있다.
이러한 인체세포 내에서의 genomic DNA의 분리, 증폭법으로 얻어진 CFTR gene은 gene therapy를 위해 활용될 수 있을 것이다.
