Human granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) is the most widely used human hemopoietic factors to remedy different forms of neutropenia, chemotherapy-induced leucopenia, and in the mobilization of progenitor cells for autologuous or allogenic transplantation. This colony stimulating factor maintains the level of blood cells within narrow limits, regulate and coordinate the proliferative activity of hemopoietic tissue, and play an essential role in response to emergent situations; for example, blood loss, or acute infection, and so on. Although these factors have been produced by many production technologies, recombinant human colony stimulating factors expressed using E.coli and yeast cell culture were approved for clinical applications. For their production in the large amount and cheaper expense, the method using the milk of transgenic animal, so called animal bioreactor, was introduced.
For mammary gland-specific expression of human GM-CSF in the transgenic animal, goat β-casein promoter was used in the construction of expression cassette. Two fragment in the three in various length, 0.72kb, 1.76kb were amplified by polymerase chain reaction from goat genomic DNA and one, 6.18kb, was prepared from pBC1 vector by restriction-enzyme digestion. And human GM-CSF structural gene was also amplified by polymerase chain reaction from human genomic DNA.
First of all, to make β0.72pGbc-hGMCSF, I subcloned human GM-CSF structural gene in front of bovine growth hormone (BGH) terminator of pRc/RSV vector and then subcloned 0.72kb goat β-casein promoter fragment before human GM-CSF structural gene. And for β1.76pGbc-hGMCSF 1.76kb goat β-casein promoter fragment was subcloned in pBluescriptII SK and human GM-CSF structural gene and BGH terminator part which was prepared from β0.72pGbc-hGMCSF by restriction enzyme was subcloned behind 1.76 goat β-casein promoter fragment. Also for β6.18pGbc-hGMCSF human GM-CSF structural gene and BGH terminator part which was prepared from β0.72pGbc-hGMCSF by restriction enzyme was subcloned in pBluescript II SK and 6.18kb goat β-casein promoter fragment subcloned in front of human GM-CSF structural gene.
The efficacy of the method "animal bioreactor" was investigated in the model transgenic mouse. Expression cassettes of β0.72pGbc-hGMCSF, β1.76pGbc-hGMCSF, β6.18pGbc-hGMCSF were isolated and microinjected into male pronuclei of mouse fertilized zygotes. After microinjection of β0.72pGbc-hGMCSF, 593embroys were transferred to pseudopregnant recipient mice and 6 transgenic mice were obtained from 96 offspring. In the case of β1.76pGbc-hGMCSF, 553 embryos microinjected were transferred and 9 transgenic mice were from 50 littermates. 596 embryos microinjected with β6.18Gbc-hGMCSF were transferred and 10 transgenic mice were obtained from 45 progenies.
The levels of human GM-CSF expressed in the transgenic mice milk were varied from 807±0.1 pg/ml upto 230±6.2 ug/ml. The secreted human GM-CSF exhibited unsaturated and saturated glycosylation. The glycosylation level was higher than commercially available human GM-CSF.
The biological activity of human GM-CSF was confirmed based on the proliferation of human GM-CSF dependent AML-193 cells after the addition of the culture media. There was no significant difference in the biological activity in the culture media compared to commercially available human GM-CSF.
사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자는 여러가지 호중구 감소증, 화학요법에 의해 유도되는 백혈구 감소증의 치료 및 이식수술을 위한 분화된 조혈세포들의 mobilization에 가장 많이 이용되고 있는 사람 조혈 성장인자이다. 이 콜로니 자극 인자는 혈구 세포들의 수를 좁은 범위내에서 유지되도록 하며 조혈조직의 생장활성을 조절하며 동시에 예를 들어 혈액 손실이나 급성 감염등의 긴급한 상황에서 중요한 역할을 수행한다. 이들 인자들은 지금까지 여러가지 방법에 의하여 생산되어왔지만 지금까지 대장균과 효모에서 생산된 재조합 콜로니 자극인자들만이 임상적 이용을 승인받은 상태이다. 이들 조혈인자들을 대량으로 저렴하게 생산하기 위하여 형질전환 동물의 유즙을 이용하는 동물 생체 배양기라고 불리우는 방법을 도입하였다.
형질 전환 동물에서 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자의 유선 조직 특이적으로 발현하기 위하여 흑염소의 베타카제인 프로모터를 이용하여 발현체를 구성하였다. 세 종류의 프로모터 중에서 두 종류인 0.72kb와 1.76kb의 프로모터는 중합효소 연쇄 반응을 통하여 증폭되었고 6.18kb의 프로모터는 제한효소 처리에 의해 pBC1이라는 벡터로부터 만들어 졌다. 그리고 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자의 유전자는 사람 게놈 DNA를 주형으로 해서 중합효소 연쇄 반응을 통해 만들어졌다.
제일 먼저 β0.72pGbc-hGMCSF를 만들기 위하여 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자의 구조 유전자를 pRc/RSV 벡터의 소 성장호르몬 전사종결부위 앞에 삽입한 다음 0.72kb의 흑염소 베타-카제인 프로모터를 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 구조 유전자의 앞에 넣었다. 그리고 β1.76pGbc-hGMCSF를 만들기 위해 1.76kb의 흑염소 베타-카제인 프로모터를 pBluescriptII SK에 넣었고 그 후 pRc/RSV 벡터내의 β0.72pGbc-hGMCSF에 있는 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 구조 유전자와 소 성장호르몬 전사종결부위를 제한효소로 처리한 분리한 후 pBluescriptII SK에 있는 1.76kb의 흑염소 베타-카제인 프로모터 뒤에 삽입하였다. 또한 β6.18pGbc-hGMCSF를 만들기 취해 pRc/RSV 벡터내의 β0.72pGbc-hGMCSF에 있는 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 구조 유전자와 소 성장호르몬 전사종결부위를 제한효소로 처리 분리한 후 pBluescriptII SK에 넣은 후 pBC1벡터로부터 제한효소 처리를 통해 얻은 6.18kb의 흑염소 베타-카제인 프로모터를 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자의 구조 유전자 앞에 삽입하였다.
동물 생체 배양기라고 불리우는 방법의 유효성을 형질전환 모델 생쥐를 제작 이를 통해 조사하였다. β0.72pGbc-hGMCSF, β1.76pGbc-hGMCSF 그리고 β6.18pGbc-hGMCSF의 발현 카세트들은 생쥐 수정란의 웅성전핵에 미세주입하였다. β0.72pGbc-hGMCSF를 주입한 경우, 593개의 배아들을 대리모에 이식하여 96수의 산자들을 얻었고 이로부터 6마리의 형질전환 생쥐가 얻어졌다. β1.76pGbc-hGMCSF의 경우, 553개의 배아가 미세주입된 후 이식되어서 50마리의 산자가 태어났고, 이들 중 9마리의 형질전환 생쥐를 얻었다. β0.72pGbc-hGMCSF를 596개의 배아에 미세주입하여 총 45마리의 산자들을 얻었고 10마리의 형질전환 생쥐가 확인되었다.
이들 형질전환 생쥐들의 유즙에서 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자는 807±0.1 pg/ml - 230±6.2 ug/ml의 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었다. 발현된 사람 과립구 콜로니 자극인자는 포화된 것과 포화되지 못한 당쇄화를 보였다. 당쇄화의 수준은 상업적으로 이용되고 있는 당쇄화된 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자와 비교할 때 더 높았다.
사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자의 생물학적 활성은 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자에 의존하여 분화를 하는 AML-13 세포의 분화정도를 조사함으로써 이루어졌다. 생물학적 활성은 상업적으로 이용되고 있는 사람 과립구 대식세포 콜로니 자극인자와 비교해서 별 차이가 없었다.
