Antimicrobial peptides have been known to act as the first line of mucosal host defense by exerting broad-spectrum microbicidal activity against invading pathogenic microbes. Parasin I, a potent 19-residue inducible antimicrobial peptide, was recently isolated from the skin mucus of wounded catfish, Parasilurus asotus. The amino acid sequence of parasin I was identical to the N-terminal region of histone H2A. Previous study suggested that parasin I might be produced from histone H2A by an unknown proteolytic cleavage. In this study, we demonstrated the mechanism of parasin I production in catfish skin mucosa upon epidermal injury and assessed the biological role of parasin I in the innate host defense. Cathepsin D was found to exist as an inactive proenzyme (procathepsin D) in the mucus, and a metalloprotease, induced upon injury, activated the procathepsin D to active cathepsin D, which consequently cleaved the $Ser^19-Arg^20$ bond of histone H2A to produce parasin I. Using recombinant procathepsin D as a substrate, we identified the procathepsin D-processing metalloprotease in the mucus of wounded catfish. The purified enzyme, named Pa-metalloprotease, carried out the activation of procathepsin D to mature cathepsin D by cleaving specifically the $Phe^290-Gly^291 bond of procathepsin D. Sequence analysis of the cDNA encoding Pa-metalloprotease showed that Pa-metalloprotease had a significant homology with matrix metalloproteinases. Immunohistochemical analysis revealed that unacetylated histone H2A, a precursor of parasin I, and procathepsin D were present in the cytoplasm of epithelial mucous cells, and parasin I was produced and secreted to the mucosal surface upon epidermal injury. Western blot analysis showed that parasin I was also present in the skin mucus of other fish species. Furthermore, parasin I showed a strong antimicrobial activity against fish-specific pathogens. Together, these results indicate that Pa-metalloprotease and cathepsin D are involved sequentially in the production of the potent antimicrobial peptide parasin I from histone H2A, which contributes to the innate host defense of the fish against invading microorganisms.
최근 수 년간의 연구 결과 거의 모든 생물체들이 외부 미생물의 침입으로 부터 자신을 방어하기 위한 수단으로 면역 체계와는 별도로 항균펩타이드를 이용하고 있음이 밝혀졌다. 메기 표피에서 상처에 의해 발현이 유도되는 항균펩타이드인 파라신 I은 아미노산 서열이 염색질 구성 단백질의 하나인 히스톤 H2A의 N-말단 부분과 일치하여 히스톤 H2A에서 유래한 것으로 생각된다. 본 연구에서는 파라신 I의 정확한 생성 기작과 생체방어 기능을 규명하였다.
파라신 I은 메기 표피의 점액질 분비 세포에서 분비된 unacetylated 히스톤 H2A로부터 metalloprotease와 cathepsin D의 연속적인 작용에 의해 생성됨을 관련 효소 분리와 유전자 클로닝을 통해 밝혔다. 그 결과, 상처에 의해 발현이 유도된 metalloprotease가 활성이 없는 procathepsin D를 cathepsin D로 활성화시키고, 활성화된 cathepsin D가 히스톤 H2A의 N-말단 부분을 절단하여 파라신 I을 생성함을 알 수 있었다. 그리고, 재조합 procathepsin D를 기질로 사용하여 procathepsin D를 cathepsin D로 활성화 시키는 metalloprotease를 상처를 입은 메기의 표피에서 분비된 점액질로부터 분리하고, 이를 Pa- metalloprotease라 명명하였다.
면역화학적 분석을 통하여 파라신 I이 메기 표피를 덮고 있는 점액질 층에 존재함을 알 수 있었으며, 파라신 I에 특이적인 항체를 이용하여 분석한 결과 파라신 I이 메기 뿐만 아니라 다른 어류의 점액에도 존재함을 알 수 있었다. 또한 파라신 I이 어류 병원균들을 효과적으로 죽이는 것을 확인하였다.
이상의 결과로부터 파라신 I이 어류의 표피에서 외부 미생물의 침입을 차단함으로써 생체방어기작에 중요한 역할을 수행하는 것을 알 수 있었다. 이는 지금까지 단순히 염색질 구성 단백질로만 알려진 히스톤 H2A가 어류 표피에서 강력한 항균펩타이드인 파라신 I으로 전환됨으로써 생체방어에 이용된다는 새로운 이론적 토대를 제공하는 것이다.
