The first event in viral infection of the host cell is binding of the virus to the cell surface. The cell-surface molecule with which the virus first specifically interacts or binds is called the virus receptor. This binding of the virus particle to the receptor involves numerous noncovalent interactions between the virion surface and the receptor, the sum of virus particle and a cell-surface molecule. Presumably, viruses have evolved to use receptors that are present on cells that have special features desired by the virus, either a permissive environment for its replication or a unique environment for a persistant infection. The basis of the cell and tissue tropisms of viruses is often related to the ability of the virus to bind a specific viral receptor. It has become clear that a virus-host binding can play an important role in determining the ultimate tropism of a virus. Compared with other members of Bunyaviridae family, the tropism of Hantaan virus is not clear yet. Although all of 12 different cell lines tested in these studies originated from different tissues and species, Hantaan virus was infected to the most of cell line. This suggested that Hantaan virus have a broad spectrum of tropism for species and organ. The pan-tropic pattern of Hantaan virus infection means that cellular receptor for Hantaan virus may be a common protein to a mammalian cell. There are several methods to identify a receptor for virus, classified by a manner to approach. A method using monoclonal antibody to protein assumed as receptor is easy to perform, but it is necessary to isolate and purify a receptor ultimately. We attempted to isolate and purify a putative receptor for Hantaan virus from cell membrane protein of cells. For this work, we determined Vero E6 cells capable of mass culture as target cell. To identify the molecules on cells which bind to Hantaan virus, VOPBA was performed with radiolabeled Hantaan virus. We found a 30-kDa protein that is putative receptor for Hantaan virus. The soluble 30-kDa protein was bound to Hantaan virus in solution specifically and inhibited Hantaan virus from infection to Vero E6 cells. The polyclonal antibody to the soluble 30-kDa protein blocked 30-kDa protein on Vero E6 cells and reduced the viral infection by 70%. Our results show that Hantaan virus specifically binds to Vero E6 cells in a dose-dependent and saturable manner, which is characteristic of specific receptor-ligand interactions, suggesting the presence of a specific receptor for Hantaan virus on the surface of Vero E6 cells. Trypsin treatment of the cells inhibited virus binding. These results were supported by overlay assays, where we could demonstrate the binding of labeled Hantaan virus to a 30-kDa protein in the membrane fraction of Vero E6 cells. The susceptibility of the binding molecule to protease treatment was confirmed in these assay, where trypsin treatment prevented the recognition of the 30-kDa protein from labeled Hantaan virus. This result suggests that the 30-kDa protein bound with Hantaan virus is located on the surface of Vero E6 cells. The 30-kDa protein do not appear to be disulfide-linked subunits, since in the presence or absence of β-mercaptoethanol both protein band showed the same molecular weight in VOPBA. Moreover, Hantaan virus binding dose not require a folding dependent on disulfide bridges. The presence of the 30-kDa protein on the surface of the Vero E6 cells and the fact that electroeluted protein and antibody against them inhibits Hantaan virus binding strongly support the idea that the 30-kDa proteins are putative receptors or part of a receptor complex for Hantaan virus. We are aiming our efforts at the complete characterization of the DNA and amino acid sequences of protein, to confirm that the 30-kDa protein is indeed Hantaan virus receptor.
바이러스가 숙주세포내에 들어가는 감염과정은 세포의 수용체와 바이러스 간의 특이적인 결합이 필수적이다. 바이러스가 감수성 세포를 구분하여 감염하는 능력(tropism)은 세포의 바이러스에 대한 수용체 존재 여부와 밀접한 관계에 있다. 세포 수용체와 바이러스간의 결합은 매우 친화력이 높고 특이적인 반응이다. Bunyaviridae과의 다른 바이러스와 비교하여 한탄 바이러스는 tropism이 명확하지 않다. 본 연구에서 조직과 동물의 기원이 각기 다른 12가지의 세포주를 가지고 감염실험을 실시한 결과, 대부분의 세포에서 한탄 바이러스가 감염되었다. 이러한 사실은 한탄 바이러스가 광범위한 tropism을 가지고 있다는 것을 의미한다. 또한 각 세포에서의 한탄 바이러스의 세포 수용체는 공통된 구조를 가지고 있을 것으로 추정된다.
바이러스의 수용체를 찾아내는 방법은 여러가지가 보고되고 있으며 이들 중에서 수용체로 추정되는 성분에 대한 단일 항체를 사용해서 검색하는 방법이 많이 사용되고 있다. 그러나, 이러한 방법은 결국에 수용체를 세포로부터 분리, 정제 하여야만 확인 될 수 있으므로 적합한 방법은 아니다. 본 연구에서는 한탄 바이러스에 감수성을 가지는 Vero E6 세포로부터 직접 수용체를 확인하고 분리하는 방법을 사용하였다.
세포상에서 바이러스가 결합하는 분자를 찾기 위해 방사선 동위원소로 표지된 한탄 바이러스를 이용한 바이러스 중층법 (VOPBA) 및 세포에 대한 직접결합법을 실시하였다. Vero E6 세포 실험에서 한탄 바이러스는 특이적으로 이 세포와 결합함을 확인 할 수 있었다. 따라서, Vero E6 세포에는 한탄 바이러스에 대한 수용체가 존재하고 있음을 확인할 수 있었다. 바이러스와 결합하는 수용체를 찾기 위해 세포막 단백질을 분리한 후 전기 영동 방법으로 전개 시킨 후 방사선 동위원소로 표지된 한탄 바이러스와 결합시켜 이 바이러스가 결합하는 세포막 단백질을 검색하였다. 그 결과 30kDa의 분자량을 가진 세포막 단백질이 확인되었다. 이 30kDa 단백질과 한탄 바이러스의 결합은 매우 특이적이며 바이러스의 감염에 직접적으로 영향을 끼친다는 것을 확인하였다. 전체 세포막 단백질로부터 30kDa 단백질을 분리, 정제한 후 한탄 바이러스와의 결합 실험을 실시한 결과 서로 매우 특이적으로 결합하는 것을 알 수 있었다. 또한 사전에 30kDa 단백질로 처리된 한탄 바이러스는 Vero E6 세포에 대한 감염력을 상실하였다. 30kDa 단백질에 대한 항체를 제조하여 세포에 처리한 결과 세포상에서 30kDa 단백질 부위가 차단되어 바이러스 결합이 저해되고 따라서 감염 또한 억제되었다. 세포에 대한 trypsin 처리는 이 30kDa 단백질이 세포의 표면에 있음을 알 수 있게 했다. 이상의 실험 결과를 종합하면, 이 30kDa 단백질은 세포의 표면에 존재하는 세포막 단백질이며, 한탄 바이러스와 선택적으로 결합하며, 바이러스의 감염에 관여하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 연구에서 확인된 30kDa 단백질은 한탄 바이러스의 세포 수용체의 가능성이 매우 큰 것으로 판단된다. 현재 계속 진행중인 30kDa 단백질에 대한 추가 정제와 amino acid sequencing이 완료되어 구체적인 이 단백질의 종류가 밝혀진다면 한탄 바이러스의 감염 기작의 원리를 밝히는데 중요한 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
