Commercial lipases and proteases were tested for the selective acylation of monosaccharides and sugar alcohol through the transesterification of activated amino acid esters. A commercialized protease from Bacillus licheniformis, Optimase M-440 showed the highest catalytic activity in the transesterification of N-t-Boc-L-Phe-OTFE with D-glucose and D-sorbitol.
The broad substrate specificity of Optimase M-440 was effective for the acylation of monosaccharides and sugar alcohols with various amino acid esters. Trifluoroethyl ester of L-phenylalanine was more effective for the transesterification than trichloroethyl ester, cyanomethyl ester and oxime ester. Various solvents were tested for the transesterification with Optimase M-440 as a reaction medium. Optimase M-440 catalyzed the highest conversion in pyridine among the tested organic solvents. Optimase M-440 showed a broad substrate specificity towards trifluoroethyl esters of amino acids and the transesterification of L-form of phenylalanine was faster than D-form.
Optimase M-440 exhibited a preferable catalytic activity on the primary hydroxyl group of monosaccharides and sugar alcohols and the regioselectivity was confirmed by the $^13C-NMR$ of the conjugates of amino acid and saccharides. The acylation occurred at the primary hydroxyl groups of D-glucose, and regioselectivity and chemoselectivity of Optimase M-440 was observed in acylation of D-glucosamine.
Optimase M-440 catalyzed the acylation of two primary hydroxyl groups of sugar alcohols in spite of the change of reaction conditions. Sugar alcohol conjugates of N-t-Boc-L-Phe-OTFE and N-t-Boc-L-Met-OTFE were synthesized without the acylation of secondary hydroxyl groups.
In the transesterification of Nα, Nε-di-t-Boc-L-Lys-OTFE$ and N-t-Boc-L-Asp-diOTFE, Optimase M-440 did not discriminate the glycosidic hydroxyl groups. Only when the glycosidic -OH was blocked, Optimase M-440 could selectively catalyze the acylation of primary hydroxyl group without other acylation. 6-(Nα, Nε-di-t-Boc-L-Lys-O)-α-Me-Glc and 6-(N-t-Boc-L-Asp-4-TFE-O)-β-Me-Glc was regioselectively synthesized in 78% and 68%, respectively. Optimase M-440 favors hydrophobic character (methionine, phenylalanine) over basic (lysine) or acidic (aspartic) character of amino acids.
N-protection group, t-Boc groups of the synthesized amino acid-sugar alcohol conjugates were deprotected without the cleavage of ester-linkage. Diamine compounds, which were synthesized by deprotection of t-Boc group, were polymerized with glutaraldehyde and diisocyanate. From 1,6-di-O-L-phenylalanyl mannitol ester and glutaraldehyde, linear polymer with molecular weight of 8,928 was synthesized. Poly(ester-urea-urethane) was obtained in the reaction of diamine compounds and hexamethylene diisocyanate.
Transesterification of an amino acid ester with Optimase M-440 is a valuable method to modify carbohydrates for numerous applications. Further modification of the amino acid with various functionalities will make it possible to design new conjugates with decent properties. The high selectivity of Optimase M-440 will also be useful to synthesize biodegradable polymers containing amino acid and sugar.
당과 아미노산의 콘쥬게이트를 효소를 이용하여 합성하기 위해 유기용매에서 활성이 높은 것으로 알려진 10개의 효소를 테스트하였다. 10개의 서로 다른 효소 중에서, Bacillus licheniformis에서 유래된 Optimase M-440이 N-t-Boc-L-Phe-OTFE과 D-glucose, D-sorbitol의 에스테르 교환반응에서 가장 좋은 활성을 보여주었다. 다양한 아미노산 에스테르의 에스테르 교환반응에서 높은 전환율을 확인하여 Optimase M-440의 넓은 기질 특이성을 확인하였다. Optimase M-440에 의한 에스테르 교환반응에서 단당류와 당 알코올(sugar alcohol)은 아실기의 받개(acceptor)로서 높은 활성을 보였다. 다양한 유기용매 중에서 pyridine을 반응 용매로서 사용하였을 때 Optimase M-440의 활성이 가장 높았다. Pyridine을 반응용매로 한 아미노산 에스테르의 교환반응에서 일차 알코올기가 존재하는 당류와 L-form 아미노산의 trifluoroethyl ester에 대해 Optimase M-440의 활성이 가장 높은 것을 확인하였다.
Optimase M-440에 의한 D-glucose와 N-t-Boc-L-Phe-OTFE의 에스테르 교환반응으로 6-(N-t-Boc-Phe-O)-D-glucose를 93%의 수율로 부산물 없이 선택적으로 합성하였다. D-glucosamine과 N-t-Boc-L-Phe-OTFE의 에스테르 교환반응에서는 Optimase M-440의 chemoselectivity와 위치선택성에 의해서 aminolysis 없이 6-(N-t-Boc-Phe-O)-D-glucosamine를 79%의 수율로 선택적으로 합성하였다.
당 알코올과 아미노산의 콘쥬게이트 합성에 있어서도 Optimase M-440의 높은 위치선택성에 의해서 모두 일차 알코올기에만 선택적으로 아실화된 생성물을 합성하였다. D-sorbitol과 N-t-Boc-L-Phe-OTFE, N-t-Boc-L-Met-OTFE의 에스테르교환반응으로 1,6-di(N-t-Boc-L-Phe-O)-D-sorbitol과 1,6-di(N-t-Boc-L-Met-O)-D-sorbitol를 다른 부반응없이 각각 89%, 79%의 수율로 합성하였다. Pyridine 대신 acetone을 반응 용매로 사용한 경우에도 다른 부산물 없이 1,6-di(N-t-Boc-L-Phe-O)-D-sorbitol과 1,6-di(N-t-Boc-L-Met-O)-D-sorbitol을 81%와 67%의 수율로 합성하였다.
Nα, Nε-di-t-Boc-L-Lys-OTFE의 에스테르 교환반응에서는 Optimase M-440의 위치선택성이 낮아 다른 아미노산 에스테르와는 다르게 일차 알코올기와 글리코시드 알코올기에 모두 아실화 반응이 일어났다. D-glucose의 경우 C6의 일차 알코올기와 C1의 글리코시드 알코올기에 각각 lysine 에스테르가 형성되었으나, 동시에 두 알코올기의 아실화 반응은 일어나지는 않았다. D-glucose의 methyl glycoside의 경우에는 다른 부반응 없이 6-(Nα, Nε-di-t-Boc-L-Lys-O)-α-Me-Glc와 6-(Nα, Nε-di-t-Boc-L-Lys-O)-β-Me-Glc가 78%와 76%로 합성되었다.
N-t-Boc-L-Asp-diOTFE의 에스테르 교환반응에서도 Optimase M-440의 활성은 높은 반면, 위치선택성이 낮아 lysine의 경우와 마찬가지로 일차 알코올기뿐만 아니라 글리코시드 알코올기에도 아실화 반응이 일어났다. 그러나, 두개의 trifluoroethyl ester기 중에서 1-ester에만 교환반응이 일어났다. Methyl glycoside를 이용하여 6-(N-t-Boc-L-Asp-4-TFE-O)-α-Me-Glc와 6-(N-t-Boc-L-Asp-4-TFE-O)-β-Me-Glc를 68%와 63%로 선택적으로 합성하였다.
Optimase M-440의 경우 lysine이나 aspartic acid과 같은 산성 또는 염기성의 성질을 가지는 아미노산보다 phenylalanine과 methionine 등의 소수성의 성질을 가지는 아미노산의 에스테르 교환반응에 있어 높은 활성과 뛰어난 위치선택성을 가지는 것을 확인하였다.
합성된 아미노산-당 알코올의 콘쥬게이트를 고분자 합성을 위한 단량체로 사용하기 위해서 trifluoroacetic acid를 사용하여 ester bond의 손상없이 t-Boc기를 제거하였다. Amine $(-NH_2)$ 기를 두개 가지는 아미노산-당 알코올 콘쥬게이트와 glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate를 사용하여 고분자를 합성하고 분자량을 GPC로 분석하였다. Glutaraldehyde와 1,6-di-O-L-phenylalanyl mannitol ester의 축합반응을 통하여 분자량이 8,928인 선형고분자를 합성하였고, 아미노산-당 알코올 콘쥬게이트와 hexamethylene diisocyanate로부터 poly(ester-urethane-urea)의 gel을 합성하고 IR spectrum으로 확인하였다.
