Immunosuppressants are a class of compounds that reduce the effects of an activated immune system. These compounds have been clinically effective in suppressing the organ graft rejection and in the treatment of autoimmune diseases. The most widely used class of immunosuppressants is the natural products originally isolated from cultures of microorganisms. Among them, cyclosporin A, FK-506, and rapamycin are the most well known immunosuppressants. In the course of screening for immunosuppressants from microorganisms, we isolated prodigiosin (PDG) from the culture broth of Serratia marcescens. This study was directed at investigating pharmacological and toxicological properties of PDG. Almost all current immunosuppressive drugs target T cells, since these cells are crucial in the initiation and progression of both graft rejection and autoimmune diseases. Thus, we first investigated cell-type specificity of PDG. PDG selectively inhibited concanavalin A (Con A)-induced T cell proliferation, but had little effect on lipopolysaccharide (LPS)-induced B cell proliferation. In addition, PDG selectively inhibited the T cell-mediated immune functions such as mixed lymphocyte response and specific IgM production to T-dependent antigen sheep red blood cells. However, PDG did not affect LPS-induced polyclonal IgM antibody production of B cells and LPS-induced NO production of macrophages. We verified that PDG at fully active concentration (＜30 ng/ml) did not induce cell death as determined by propidium iodide uptake experiment. PDG also did not show toxicity in vivo to lymphoid organs at effective dosages (＜30 mg/kg). These results suggested that PDG was T cell specific immunosuppressants. We further investigated the mechanism of action of PDG in T cells. As a first step towards understanding the mode of action of PDG in T cells, we investigated the effect of PDG on the IL-2/IL-2R autocrine pathway, because the synthesis and action of IL-2 were the major targets of most immunosuppressants. Although PDG did not block IL-2 production, it efficiently inhibited IL-2Rα expression, and this resulted in a disruption of the IL-2/IL-2R signaling pathway, on which a great part of the regulation of T cell differentiation depended. PDG blocked T cell differentiation into effector Th cells secreting IFN-γ and IL-4 as well as into effector cytotoxic T lymphocytes expressing perforin, which was partially at least resulted from inhibition of the IL-2/IL-2R signaling. PDG did not inhibit signaling events triggered by the IL-2R ligation with IL-2. PDG indirectly blocked STAT activation by inhibiting cytokine production in Con A activated T cells, although it did not inhibit the activation of NF-κB, NF-AT and AP-1. As direct evidence of immunosuppression in vivo, we investigated the effect of PDG on development of autoimmune diseases and graft rejection. PDG efficiently delayed the progression of autoimmune diabetes, as determined by reduced blood glucose levels and cellular infiltration into the pancreatic islets. This compound also markedly delayed the onset of rheumatoid arthritis, as analyzed by the macroscopic arthritis score and the histological features of the joints. In addition, PDG efficiently decreased the enlargement of popliteal lymph nodes in graft versus host reaction. In conclusion, our results demonstrated that PDG blocked T cell activation by inhibiting selectively IL-2Rα expression in the IL-2/IL-2R signaling pathway, and suggested that this compound represented a promising immunosuppressant candidate for the treatment of graft rejection and autoimmune diseases.
면역억제제는 비정상적으로 활성화되어 있는 면역반응을 억제하는 물질로서 장기이식거부반응의 억제와 자가면역질환의 치료에 사용된다. 대표적인 면역억제제로는 cyclosporin A, FK-506, rapamycin 등이 있으며 이들은 대부분 미생물로부터 개발되었다. 본 연구에서는 Serratia marcescens 미생물에서 분리한 신규 면역억제 후보 물질인 prodigiosin (PDG)의 약리학적 특성을 규명하였다.
Graft rejection 및 autoimmune disease의 발병에는 T cell이 긴밀하게 관여하고 있다고 알려져 있으며, 따라서 현재 개발되었거나 개발중인 대부분의 면역억제제는 T cell의 면역기능 억제를 표적으로 하고 있다. 본 연구의 첫번째 목적은 PDG의 세포 선택성을 규명하는 하는 것이다. PDG는 concanavalin A-induced T cell proliferation을 억제하였으나, lipopolysaccharide-induced B cell proliferation은 억제하지 못하였다. 또한 PDG는 mixed lymphocyte response및 T-dependent antibody response 등의 T cell이 관여하는 면역반응은 강하게 억제하였으나, B cell의 polyclonal IgM antibody production 및 macrophage의 nitrite 생성은 억제하지 못하였다. 이와 같은 면역억제를 나타내는 농도에서 PDG는 cell death를 유발하지 않았음을 propidium iodide staining 법으로 확인하였다. 이상의 연구결과로부터 PDG는 T cell의 면역기능을 선택적으로 억제하는 면역억제제임을 알 수 있었다.
대부분의 T cell specific immunosuppressant는 cytokine의 생성 및 작용을 억제하는 기전을 보여주고 있다. 특히, T cell activation에서 중요한 기능을 하고 있는 IL-2의 생성 및 작용기전은 주요 표적이 되고 있다. 대표적인 면역억제제인 cyclosporin A 및 FK-506은 IL-2 생성을 억제하며, rapamycin은 IL-2-dependent signaling pathway를 억제한다고 알려져 있다. 본 연구의 두 번째 목적은 PDG의 면역억제기전을 IL-2/IL-2 receptor (IL-2R) signaling pathway를 중심으로 규명하는 것이다. IL-2의gene expression에 대한 영향은 quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) 을 이용하여 측정하였으며, IL-2 production에 대한 영향은 ELISA를 이용하여 측정했다. 그 결과 PDG는 IL-2 생성을 억제하지 못함을 알 수 있었다. 반면에 PDG는 IL-2R α-chain (IL-2Rα) 의 gene expression 및 T cell surface expression을 강하게 억제하고 있음을 quantitative RT-PCR 및 flow cytometric analysis를 이용하여 확인하였다. IL-2Rα의 선택적인 억제는 IL-2/IL-2R signaling pathway를 억제할 수 있으며, 이로 인해 T cell activation이 억제된 것으로 판단된다. 현재까지 IL-2R 생성을 선택적으로 억제하는 면역억제제는 보고된 적이 없기 때문에, PDG는 상당히 독특한 작용기전을 가진 물질로 사료된다. PDG는 helper T cell에서 만들어지는 IL-4 및 IFN-γ의 생성을 강하게 억제했으며, cytotoxic T lymphocytes의 perforin 발현을 강하게 억제했다. 이들의 발현억제는 PDG의 direct inhibition에 의해 유발될 수도 있지만, IL-2/IL-2R signaling pathway의 억제에 의해 간접적으로 유발될 수도 있다. PDG는 mitogen-activated T cell에서 signal transducers and activators of transcription (STAT)을 활성화시키는cytokine의 production을 억제하여 STAT activation을 간접적으로 억제하였으나, NF-κB, NF-AT, AP-1 등의 transcription factor에는 영향을 주지 않았다.
면역억제제는 장기이식 거부반응 억제 및 자가면역질환의 치료를 위하여 사용되는데, 본 연구의 세 번째 목적은 PDG의 질환치료효과를 구명하는 것이다. PDG는 장기이식 시험계로 사용되는 graft versus host reaction을 억제하였다. 또한 NOD mouse에 PDG를 4개월동안 투여했을 때, 혈당 및 췌도염이 감소하여 자가면역성 당뇨병이 발병을 억제하고 있음을 확인하였으며, collagen을 주사하여 관절염을 유발시킨 DBA/1 mouse에 40일 동안 PDG를 투여하였을 때 관절염 유발이 현저히 억제됨을 확인하였다.
이상의 연구를 통하여, PDG는 IL-2Rα expression을 선택적으로 억제하는 T cell specific immunosuppressant임을 알 수 있었으며, 장기이식거부반응 및 자가면역질환 발병에 유효한 효과가 있음을 확인하였다.
