To identify the genes related with light signal transduction and gliding motility in cyanobacterial phototaxis, phototactic mutants were isolated using random and target mutagenesis and characterized by computerized motion analysis system in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Using UV mutagenesis, we initially isolated 5 types of phototactic mutants, such as negative, random, weak positive, weak negative and nonmotile mutants, based on phototactic gliding on the agar surface. We found negative and random mutants had a lesion(s) not in a photo-perception part but in an intracellular light signaling. Also one of the weak positive mutants did not have phototactic response only to far-red (730 nm) light. We suggest that these mutants can be used for identification of the genes related with light signal transduction and phototactic gliding motility.
Also we performed random Tn5 mutations in Synechocystis sp. PCC 6803 in search for genes involved in phototactic gliding movement. One of the nongliding Tn5 mutant, S1-105, had an insertional inactivation in the slr1044 gene encoding a putative methyl-accepting chemotaxis protein. Interposon mutation on the slr1044 also eliminated gliding motility. This slr1044 was a part of a gene cluster (slr1041, slr1042, slr1043 and slr1044), which encodes proteins that have significant sequence similarity to chemotaxis proteins in enterics. So we renamed slr1044 ctr1 (cyanobacterial transducer). In the ctr1 interposon mutant, the expression of pilA1 was decreased 5-fold less than that of wild type, and also thick pili, that is believed to be motor for gliding, could not be observed by electron microscope. Therefore, we suggest that the Ctr1 protein function as a transducer that regulates the expression of pilA1, and thus is required for the biogenesis of thick pili.
In addition, we found two additional gene clusters, which showed homology to chemotaxis proteins of enterics and Pil protein of the twitching bacterium P. aeruginosa. A gene cluster including sll1291 (CheY homologue in enterics), sll1292 (CheY), sll1293 (CheW), sll1294 (MCP), and sll1296 (CheA), was found in Cyanobase. Among the genes, sll1296 gene was target mutagenized. In the sll1296 inactivation mutant, both gliding motility and pilA1 gene expression pattern was very similar to those of ctr1 mutant. Therefore, a gene cluster including sll1296 was thought to be part of a signal transduction system that controlled Synechocystis pilus biogenesis and gliding motility. The second gene cluster included sll0038 (CheY homologue in enterics), sll0039 (CheY), sll0040 (CheW), sll0041 (MCP), sll0042 (MCP), sll0043 (CheA) and sll0044 (CheW). Inactivation of each gene in the gene cluster displayed negative phototaxis under the unilateral white light. The gene cluster including sll0038 through sll0044 was supposed to perceive and transduce light signal into the motor apparatus, therefore act as signal switching machinery. Specially, sll0041, renamed cpr1 (cyanobacterial phototransducer), contained GAF domain (chromophore-binding domain of phytochrome) and was required for the perception and signal transduction of green light, one of the attractant light in Synechocystis sp. PCC 6803 phototaxis.
광합성 미생물의 빛에 의한 신호 전달과 활주 운동에 관련된 유전자를 규명하기 위해서 남세균 Synechocystis sp. PCC 6803의 주광성을 모델계로 이용하였다. UV와 transposon 그리고 유전자의 선택적 불활성화와 같은 방법을 사용하여 무작위 돌연변이주를 만든 다음, 광합성 남세균이 빛을 향해서 방향성을 가지면서 활주운동을 하는 주광성을 이용하여 돌연변이주를 스크리닝 하였다. UV를 이용한 무작위 돌연변이 방법으로부터 5 개의 유형으로 분류된 총24개의 돌연변이주를 얻었다. 유형별로 보면 빛의 반대방향으로 가는 negative phototaxis 돌연변이주, 방향성을 상실한 random taxis 돌연변이주, 야생형과 같이 positive phototaxis를 갖지만 운동 능력이 약화된 weak positive phototaxis 돌연변이주, 운동성이 떨어진 negative phototaxis 돌연변이주 등을 얻었다. 이러한 돌연변이주의 분석을 위해서 한천위를 움직이는 운동성을 단세포 수준에서 분석할 수 있도록 computerized motion analysis system을 개발하였다. Negative phototaxis 돌연변이주와 random taxis돌연변이주를 파장에 따라서 분석한 결과 남세균이 양성 주광성을 갖는 적색광 (660 nm), 녹색광 (560 nm), 청색광 (460 nm) 그리고 원적색광 (730 nm) 등에서 실험한 결과, 어느 파장에서나 모두 똑 같은 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 Negative phototaxis 돌연변이주와 random taxis돌연변이주는 광수용체 수준에서 고장이 난 것이 아니라 세포 내 광신호 전달 단계에서 고장이 났음을 유추할 수 있었다. 또한 weak positive phototaxis 돌연변이주중 하나는 실험에 사용된 적색, 녹색, 파랑등에서는 정상적인 taxis를 보이는데 반해서 원적색광에서 주광성을 갖지 않는 것으로 보아 원적색광 수용체에 고장을 가지고 있는 것으로 사료된다. 광합성 남세균의 주광성 활주 운동 기전에 관계된 유전자의 탐색이 보다 용이하도록 transposon을 이용한 무작위 돌연변이를 실시하였다. Tn mutagenesis 결과 확보된 4,500의 무작위 돌연변이주중에서 운동성이 상실된 35개의 돌연변이주를 분리하였다. 그 중 하나의 돌연변이주를 in verse PCR 방법을 이용하여 유전자를 규명한 결과 대장균의 주화성 신호 전달에 관여하는 methyl-accepting chemotaxis protein (MCP)와 높은 상동성을 가진 유전자 (ctr1으로 명명함) 로 밝혀졌다. 이 유전자를 인위적으로 불활성화 시킨 결과 역시 운동성을 상실한 돌연변이주를 얻을 수 있었으며, 전자현미경으로 조사한 결과 야생형 남세균에서 주광성에 관여하는 것으로 알려진 thick pili를 관찰할 수 없었다. 또한 thick pili를 coding한다고 알려진 pilA1 유전자를 northern hybridization을 통해서 발현양을 조사한 결과 야생형에 비해서 5배정도 발현이 적게되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 ctr1 유전자는 인접부위에 대장균의 주화성 관련 유전자 (cheY, cheW, mcp gene)와 단백질 수준에서 높은 상동성을 가진 유전자군 (cheY, cheY, cheY, ctr1)으로 구성되어 있다. 따라서 Ctr1 단백질은 대장균의 주화성 신호 전달기전과 유사하게 CheW나 CheA등과 같은 단백질에 세포내(외)의 신호를 전달하는 전달자(transducer) 역할을 할 것으로 사료된다. Ctr1을 포함한 유전자군 이외에 대장균의 주화성 관련 유전자와 단백질 수준에서 상동성을 갖는 2개의 유전자군을 찾아서 각각의 유전자를 불활성화 시켰다. 하나의 유전자군은 sll1291 (cheY), sll1292 (cheY), sll1293 (cheW), sll1294 (mcp), sll1296 (cheA) 등으로 구성되어 있는데, 먼저slll1296 (cheA) 유전자를 불활성화 시켰을 경우, ctr1 유전자가 불활성화 된 것과 같이 전자현미경상에서 thick pili를 관찰할 수 없었으며, pilA1 유전자의 발현 또한 억제되었음을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터 sll1296 (cheA)을 포함한 유전자군 또한 pilus 생성과 남세균 활주 운동 기전에 관련되어 있음을 알 수 있었다. 남세균 Synechocystis sp. PCC 6803의 유전체상에는 methyl accepting chemotaxis protein 과 상동성을 가지면서 식물의 피토크롬이 갖는 발색단 결합 부위 (GAF motif)를 갖는 단백질 (Sll0041)이 존재하는데, 이 단백질을 coding하는 유전자 역시 주화성관련 단백질과 상동성을 갖는 ORF와 함께 유전자군을 형성하고 있다. 해당 유전자는 sll0038 (cheY), sll0039 (cheY), sll0040 (cheW), sll0041 (mcp), sll0042 (mcp), sll0043 (cheA), sll0044 (cheW) 등으로 구성되어 있는데, 각 유전자를 불활성화 시켰을 경우 모든 돌연변이주가 빛의 반대 방향으로 이동하는 negative phototaxis를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 sll0041불활성화 균주는 광량에 비례하여 negative phototaxis가 감소되며, high light (300 μ mol/㎡/s) 에서 positive phototaxis를 보임으로서, sll0041을 포함한 유전자군은 빛 신호를 주광성 운동계에 전달하는 신호전달계로서 작용할 것으로 추정되며, 또한 신호 전달 switcher로서 역할을 할 것으로 추측된다. 특히 sll0041이 불활성화 된 돌연변이주의 경우 남세균의 attractant light으로 사용되는 녹색광 (560 nm)을 인지하지 못하는 것으로 봐서 sll0041 (cpr1으로 명명)은 녹색광 수용체라고 판단된다.
